Fermentų aktyvumo reguliavimas.
Aktyvinimo mechanizmai.
1) Kovalentinė modifikacija (ty fermentų kovalentiniai ryšiai keičiasi)
a) dalinė proteolizė (pepsinogeną ir tripsinogeną gali paveikti ne tik druskos rūgštis ir enterokinazė, bet ir aktyvūs fermentai - atitinkamai pepsinas ir tripsinas, tai yra, vyksta autokatalizė).
b) fosforilinimas ir defosforilinimas. Fosforilinimą vykdo baltymų kinazės.
2) Aktyvaus centro užbaigimas (dažniausiai tai metalo jonai, ypač mangano, bet kai kuriais atvejais metalas susijungia su siera, tada siera lengviau sąveikauja su aktyviuoju centru).
3) Allosterinis aktyvinimas. Paprastai poveikis pasireiškia subvienetui, kuriame nėra aktyvaus centro (tai yra, tai dažniau būdinga oligomerams), tačiau šis subvienetas turi reguliavimo vietą, kurią gali paveikti koks nors metabolitas (pavyzdžiui, ADP), ir subvienetas keičia savo struktūrą, tuo pačiu pakeisdamas subvieneto, kuriame yra aktyvusis centras, struktūrą, todėl jis tampa labiau prieinamas substratui. Paprastai alosterinis aktyvinimas ir slopinimas yra savireguliacijos procesai, kai tarpiniai arba galutiniai metabolitai reguliuoja reakcijos greitį.
Struktūrinis organizavimas fermentas ląstelėje .
Kiekviena ląstelių struktūra turi tam tikrą fermentų rinkinį, leidžiantį atlikti tam tikrą funkciją. Pavyzdžiui, mitochondrijose yra fermentų, kurie gali oksiduoti tam tikrus substratus ir panaudoti gautą energiją. Branduoliai (jose yra DNR ir RNR sintezė, galinčios saugoti ir perduoti paveldimą informaciją), taip pat turi specifinį fermentų rinkinį (RNR ir DNR polimerazės ir kt.). Lizosomos (jos naikina įvairius kompleksinius junginius) taip pat turi atitinkamą fermentų rinkinį (hidrolazės, liazės ir kt.).
Visi šie fermentų rinkiniai yra griežtai struktūrizuoti, tai yra, jie yra integruoti, pavyzdžiui, į mitochondrijų membraną ( kvėpavimo grandinė) tam tikra tvarka ir yra komplekse (pavyzdžiui, kompleksas, užtikrinantis riebalų rūgščių sintezę; kompleksas, skatinantis piruvinės rūgšties konversiją) kartais net kalbama apie ląstelių struktūrų indikatorius (žymenus) fermentus (sukcinato dehidrogenazę). - mitochondrijoms, RNR polimerazė - branduoliui, rūgštinė fosfatazė lizosomoms).
Medžiagų apykaitos proceso metu fermentų aktyvumas yra nuolat reguliuojamas, tai yra, fermentas niekada neveikia monotoniškai. Yra įvairių būdų reguliuoti fermentų aktyvumą:
1) fermento kiekis gali kisti (tai yra, fermento sintezė didėja arba mažėja). Tai atsiranda dėl genų ekspresijos pokyčių.
2) Cheminė fermento modifikacija gali keistis (veikiant aktyvatoriams, inhibitoriams arba pakitus pH). Tai dalinė proteolizė, fosforilinimas ir defosforilinimas, sulfoninimas ir kt.
3) Fermentų aktyvumas kinta veikiant hormonams (įvairūs mechanizmai).
4) Fermento aktyvumą gali paveikti pats substratas arba reakcijos produktas (jis yra aktyvatorius arba inhibitorius).
5) Suskaidymo reiškinys taip pat pastebimas ląstelėse, tai yra, padedant biologinės membranos atskiriami fermentai ir tie substratai, kuriuos šie fermentai galėtų sunaikinti, bet ląstelei to nereikia (pvz., lizosomų proteinazių, fosfatazės ir kt. fermentai atskiriami nuo citoplazmoje esančių medžiagų) Arba jie atskiriami naudojant tarpusavyje nesuderinamas membranas metabolines procesai vyksta vienu metu (pavyzdžiui, riebalų rūgščių sintezė vyksta citoplazmoje, o riebalų rūgščių irimas – mitochondrijose). Ne visi fermentai yra reguliuojami. Tačiau fermentinių reakcijų grandinėje yra pagrindiniai fermentai, kurie yra aktyvuojami arba slopinami.
Fermentų išskyrimo principai .
Fermentams aptikti naudojama jų specifiškumo savybė. Jie paima tam tikrą (specifinį) substratą, parenka optimalias sąlygas (pH, temperatūra) ir prideda fermento, kad pamatytų, ar vyksta reakcija, tuo tarpu substrato koncentracija mažėja ir produkto susidarymas didėja. Kiekybinis fermentų įvertinimas pateikiamas pagal jų aktyvumą (kadangi fermentų yra nežymiai), tai yra, nustatomas fermentinės reakcijos greitis. Fermentų aktyvumas nustatomas esant pastoviai temperatūrai (25 arba 37 laipsnių Celsijaus), sukuriant optimalų pH. Šiuo atveju substrato koncentracija turi būti gana didelė. Tokiomis sąlygomis reakcijos greitis tiesiogiai priklauso nuo fermento koncentracijos \/ = K[F]. Fermento aktyvumo vienetas laikomas jo minimali suma, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ optimaliomis sąlygomis sukelia vieno mikromolio substrato virsmą per vieną minutę.
Specifinis aktyvumas yra fermentinis aktyvumas viename mg baltymo. Remiantis Tarptautinės biochemijos sąjungos komisijos rekomendacijomis dėl fermentų nomenklatūros, fermentiniam aktyvumui išreikšti siūloma naudoti katalą. 1 katalas – ϶ᴛᴏ katalizinis aktyvumas, galintis vykdyti reakciją greičiu, lygiu vienam moliui per sekundę.
Fermentų aktyvumo reguliavimas. - koncepcija ir rūšys. Kategorijos "Fermentų aktyvumo reguliavimas" klasifikacija ir ypatybės. 2017 m., 2018 m.
Fermentų aktyvumo reguliavimas. Medicininė enzimologija (biochemija)
Fermentų aktyvumo reguliavimo būdai:
1. Fermentų kiekio pokytis.
2. Fermento katalizinio efektyvumo pokytis.
3. Reakcijos sąlygų keitimas.
Fermentų reguliavimas
Fermentų molekulių skaičių ląstelėje lemia dviejų procesų santykis – baltymo fermento molekulės sintezės ir skilimo greitis.
Ląstelėje yra dviejų tipų fermentai:
1. Konstituciniai fermentai– yra esminiai ląstelės komponentai, sintetinami pastoviu greičiu pastoviais kiekiais.
2. Prisitaikantys fermentai– jų susidarymas priklauso nuo tam tikrų sąlygų. Tarp jų išskiriami indukuojami ir represuojami fermentai.
Paprastai fermentai, turintys katabolinę funkciją, yra indukuojami. Jų susidarymą gali sukelti arba paspartinti tam tikro fermento substratas. Fermentai, kurie paprastai yra slopinami, yra anaboliniai fermentai. Šių fermentų sintezės inhibitorius (represorius) gali būti galutinis šios fermentinės reakcijos produktas.
Fermentų katalizinio efektyvumo pokytis
Šio tipo reguliavimas gali vykti naudojant kelis mechanizmus.
Aktyvatorių ir inhibitorių poveikis fermentų aktyvumui
Aktyvatoriai gali padidinti fermentinį aktyvumą įvairiais būdais:
1. sudaro aktyvųjį fermento centrą;
2. palengvinti fermento-substrato komplekso susidarymą;
3. stabilizuoti natūralią fermento struktūrą;
4. apsaugoti aktyviosios vietos funkcines grupes.
Fermentų inhibitorių klasifikacija:
1. Nespecifinis.
2. Konkretus:
Negrįžtamas
Grįžtamasis:
§ konkurencingas
§ nekonkurencingas.
Nespecifiniai inhibitoriai sukelia fermento molekulės denatūravimą – tai rūgštys, šarmai ir sunkiųjų metalų druskos. Jų veikimas nesusijęs su fermentinės katalizės mechanizmu.
Negrįžtamas slopinimas
Negrįžtamas slopinimas stebimas tuo atveju, kai tarp inhibitorių molekulės ir fermento susidaro stabilūs kovalentiniai ryšiai. Dažniausiai keičiamas aktyvus fermento centras. Dėl to fermentas negali atlikti savo katalizinės funkcijos.
Negrįžtami inhibitoriai apima jonus sunkieji metalai Pavyzdžiui, gyvsidabris (Hg 2+), sidabras (Ag +) ir arsenas (As 3+), kurie mažomis koncentracijomis blokuoja aktyviosios vietos sulfhidrilo grupes. Substratas negali būti chemiškai transformuotas.
Diizopropilo fluorofosfatas (DFP) specifiškai reaguoja tik su viena iš daugelio serino liekanų aktyvioje fermento vietoje. Ser liekana, galinti reaguoti su DPP, turi identišką arba labai panašią aminorūgščių aplinką. Didelis šios liekanos reaktyvumas, palyginti su kitomis Ser liekanomis, yra dėl aminorūgščių liekanų, kurios taip pat yra įtrauktos į aktyvų fermentų centrą.
DPP klasifikuojamas kaip specifinis negrįžtamas „serino“ fermentų inhibitorius, nes jis susidaro kovalentinis ryšys su serino hidroksilo grupe, esančia aktyviajame centre ir atliekančia pagrindinį vaidmenį katalizės procese.
Monojodoacto rūgštis ir p-chlormerkuribenzoatas lengvai reaguoja su cisteino likučių SH grupėmis baltymuose. Šie inhibitoriai nėra klasifikuojami kaip specifiniai, nes reaguoja su bet kokiomis laisvomis SH baltymų grupėmis ir vadinami nespecifiniais inhibitoriais. Jei SH grupės tiesiogiai dalyvauja katalizėje, naudojant šiuos inhibitorius, atrodo, kad įmanoma nustatyti fermentų SH grupių vaidmenį katalizėje.
Negrįžtami fermentų inhibitoriai kaip vaistai
Vaisto, kurio veikimas pagrįstas negrįžtamu fermentų slopinimu, pavyzdys yra plačiai naudojamas vaistas aspirinas. Priešuždegiminis nesteroidinis vaistas aspirinas suteikia farmakologinį poveikį, nes slopina fermentą ciklooksigenazę, kuri katalizuoja prostaglandinų susidarymą iš arachidono rūgšties. Kaip rezultatas cheminė reakcija Aspirino acetilo liekana prisijungia prie ciklooksigenazės serino laisvosios galinės OH grupės.
Dėl to sumažėja prostaglandinų reakcijos produktų susidarymas, kurie turi Platus pasirinkimas biologines funkcijas, įskaitant uždegimo mediatorius.
Grįžtamasis slopinimas
Grįžtamieji inhibitoriai prie fermento jungiasi silpnais nekovalentiniais ryšiais ir tam tikromis sąlygomis lengvai atsiskiria nuo fermento. Grįžtamieji inhibitoriai gali būti konkurencingi arba nekonkurencingi.
Konkurencinis slopinimas
Konkurencinis slopinimas reiškia grįžtamąjį fermentinės reakcijos greičio sumažėjimą, kurį sukelia inhibitorius, kuris jungiasi su aktyvia fermento vieta ir neleidžia susidaryti fermento ir substrato kompleksui. Šio tipo slopinimas pastebimas, kai inhibitorius yra struktūrinis substrato analogas, todėl substrato ir inhibitorių molekulės konkuruoja dėl vietos aktyviame fermento centre. Šiuo atveju arba substratas, arba inhibitorius sąveikauja su fermentu, sudarydami fermento-substrato (ES) arba fermento-inhibitoriaus (EI) kompleksus. Susidarius fermento inhibitorių (EI) kompleksui, reakcijos produktas nesusidaro.
Klasikinis konkurencinio slopinimo pavyzdys yra sukcinato dehidrogenazės reakcijos slopinimas malono rūgštimi. Malono rūgštis yra struktūrinis sukcinato analogas (dviejų karboksilo grupių buvimas) ir taip pat gali sąveikauti su aktyvia sukcinato dehidrogenazės vieta. Tačiau dviejų vandenilio atomų paėmimas iš malono rūgšties neįmanomas; todėl reakcijos greitis mažėja.
Vaistai kaip konkurenciniai inhibitoriai
Daugelis vaistų terapinį poveikį daro konkurencinio slopinimo mechanizmu. Pavyzdžiui, ketvirtinės amonio bazės slopina acetilcholinesterazę, kuri katalizuoja acetilcholino hidrolizę į choliną ir acto rūgštį.
Pridėjus inhibitorių, acetilcholinesterazės aktyvumas mažėja, padidėja acetilcholino (substrato) koncentracija, o tai kartu sustiprėja nervinių impulsų laidumas. Cholinesterazės inhibitoriai naudojami raumenų distrofijai gydyti. Veiksmingi anticholinesterazės vaistai – prozerinas, endrofonis ir kt.
Antimetabolitai kaip vaistai
Medžiagos, vadinamos antimetabolitais, medicinos praktikoje konkurenciniu būdu naudojamos kaip fermentų inhibitoriai. Šie junginiai, būdami natūralių substratų struktūriniai analogai, viena vertus, sukelia konkurencinį fermentų slopinimą, kita vertus, gali būti naudojami tų pačių fermentų kaip ir pseudosubstratai, o tai lemia nenormalių produktų sintezę. Nenormalūs produktai neturi funkcinės veiklos; Dėl to pastebimas tam tikrų medžiagų apykaitos takų greičio sumažėjimas.
Kaip vaistai vartoti šiuos antimetabolitus: sulfonamidinius vaistus (para-aminobenzenkarboksirūgšties analogus), vartojamus gydyti užkrečiamos ligos, nukleotidų analogai, skirti vėžiui gydyti.
Nekonkurencinis slopinimas
Nekonkurencinis fermentinės reakcijos slopinimas vadinamas, kai inhibitorius sąveikauja su fermentu ne aktyvioje vietoje. Nekonkurencingi inhibitoriai nėra struktūriniai substrato analogai.
Nekonkurencinis inhibitorius gali prisijungti prie fermento arba fermento-substrato komplekso, sudarydamas neaktyvų kompleksą. Nekonkurencinio inhibitoriaus pridėjimas sukelia fermento molekulės konformacijos pasikeitimą taip, kad sutrinka substrato sąveika su aktyviuoju fermento centru, dėl ko sumažėja fermentinės reakcijos greitis.
Allosterinis reguliavimas
Allosteriniai fermentai – tai fermentai, kurių veiklą reguliuoja ne tik substrato molekulių skaičius, bet ir kitos medžiagos, vadinamos efektoriais. Alosteriniame reguliavime dalyvaujantys efektoriai dažnai yra ląstelių metabolitai tuo keliu, kurią jie reguliuoja.
Allosterinių fermentų vaidmuo ląstelių metabolizme. Alosteriniai fermentai vaidina svarbų vaidmenį medžiagų apykaitoje, nes itin greitai reaguoja į menkiausius pokyčius vidinė būsena ląstelės.
Allosterinis reguliavimas turi didelę reikšmęšiose situacijose:
1. vykstant anaboliniams procesams. Metabolinio kelio galutinio produkto slopinimas ir pradinių metabolitų aktyvinimas leidžia reguliuoti šių junginių sintezę;
2. vykstant kataboliniams procesams. Kai ATP kaupiasi ląstelėje, yra slopinami medžiagų apykaitos keliai, užtikrinantys energijos sintezę. Tokiu atveju substratai išleidžiami rezervinių maistinių medžiagų kaupimo reakcijoms;
3. koordinuoti anabolinius ir katabolinius kelius. ATP ir ADP yra alosteriniai efektoriai, kurie veikia kaip antagonistai;
4. koordinuoti lygiagrečius ir tarpusavyje susijusius medžiagų apykaitos kelius (pavyzdžiui, purino ir pirimidino nukleotidų, naudojamų nukleorūgščių sintezei, sintezę). Taigi, galutiniai produktai vieno metabolizmo kelio gali būti kito metabolizmo kelio allosteriniai efektoriai.
Allosterinių fermentų struktūros ir veikimo ypatybės:
1. dažniausiai tai yra oligomeriniai baltymai, susidedantys iš kelių protomerų arba turintys domeno struktūrą;
2. jie turi alosterinį centrą, esantį erdviniu atstumu nuo kataliziškai aktyvaus centro;
3. efektoriai prie fermento jungiasi nekovalentiškai allosteriniuose (reguliaciniuose) centruose;
4. Allosteriniai centrai, kaip ir kataliziniai, ligandų atžvilgiu gali turėti skirtingą specifiškumą: jis gali būti absoliutus ir grupinis.
Kai kurie fermentai turi kelis allosterinius centrus, iš kurių vieni būdingi aktyvatoriams, kiti – inhibitoriams;
1. protomeras, ant kurio yra allosterinis centras, yra reguliuojantis protomeras, priešingai nei katalizinis protomeras, kuriame yra aktyvusis centras, kuriame vyksta cheminė reakcija;
2. allosteriniai fermentai turi kooperatyvumo savybę: alosterinio efektoriaus sąveika su alosteriniu centru sukelia nuoseklų kooperacinį visų subvienetų konformacijos pokytį, dėl kurio pasikeičia aktyvaus centro konformacija ir pasikeičia afinitetas. substratui skirtas fermentas, kuris sumažina arba padidina fermento katalizinį aktyvumą;
3. alosterinių fermentų reguliavimas yra grįžtamasis: efektoriaus atsijungimas nuo reguliavimo subvieneto atkuria pirminį katalizinį fermento aktyvumą;
4. Allosteriniai fermentai katalizuoja pagrindines reakcijas tam tikrame metabolizmo kelyje.
Fermentų katalizinio aktyvumo reguliavimas baltymų ir baltymų sąveika.
Kai kurie fermentai keičia savo katalizinį aktyvumą dėl baltymų ir baltymų sąveikos.
Yra 2 fermentų aktyvavimo mechanizmai, naudojant baltymų ir baltymų sąveiką:
1. fermentų aktyvavimas dėl reguliuojančių baltymų prisijungimo;
2. fermentų katalizinio aktyvumo pokytis dėl fermentų protomerų susiejimo arba disociacijos.
Fermentų katalizinio aktyvumo reguliavimas fosforilinimo/defosforilinimo būdu.
Biologinėse sistemose dažnai randamas fermentų aktyvumo reguliavimo mechanizmas, naudojant kovalentinį aminorūgščių likučių modifikavimą. Greitas ir plačiai paplitęs fermentų cheminio modifikavimo būdas yra fosforilinimas/defosforilinimas. Fermento OH grupės keičiasi. Fosforilinimą vykdo baltymų kinazės fermentai, o defosforilinimą – fosfoproteinų fosfatazės. Pridėjus fosforo rūgšties liekanų, pasikeičia aktyvaus centro konformacija ir jo katalizinis aktyvumas. Tokiu atveju rezultatas gali būti dvejopas: vieni fermentai suaktyvėja fosforilinimo metu, o kiti, priešingai, tampa mažiau aktyvūs.
Fermentų katalizinio aktyvumo reguliavimas daline (ribota) proteolize.
Kai kurie fermentai, veikiantys už ląstelių ribų (virškinimo trakte arba kraujo plazmoje), yra sintetinami neaktyvūs pirmtakai ir aktyvuojami tik dėl vienos ar kelių specifinių peptidinių jungčių hidrolizės, dėl kurios suskaidoma dalis pirmtako baltymo molekulės. Dėl to likusioje baltymo molekulės dalyje įvyksta konformacinis persitvarkymas ir susidaro aktyvusis fermento centras (tripsinogenas – tripsinas).
Kraujo plazmos fermentai
Pagal kilmę kraujo plazmos fermentus galima suskirstyti į 3 grupes.
1. Nuosavi kraujo plazmos fermentai (sekretoriniai). Jie susidaro kepenyse, bet veikia kraujyje. Tai yra kraujo krešėjimo sistemos fermentai - protrombinas, proakcelerinas, prokonvertinas, taip pat ceruloplazminas, cholinesterazė.
2. Išskyrimo fermentai – patenka į kraują iš įvairių sekretų – dvylikapirštės žarnos sulčių, seilių ir kt. Tai apima amilazę ir lipazę.
3. Ląstelių fermentai – patenka į kraują, kai pažeidžiamos arba sunaikinamos ląstelės ar audiniai.
4.1 lentelė. Organams specifiniai fermentai (izofermentai)
Enzimopatijos
Daugelio ligų priežastis yra fermentų ląstelėje disfunkcija – fermentopatijos. Įgytos fermentopatijos, kaip ir apskritai proteinopatijos, pastebimos sergant visomis ligomis.
Pirminėse fermentopatijose defektiniai fermentai dažniausiai paveldimi autosominiu recesyviniu būdu. Heterozigotai dažniausiai neturi fenotipinių anomalijų. Pirminės fermentopatijos paprastai priskiriamos medžiagų apykaitos ligoms, nes sutrinka tam tikri medžiagų apykaitos keliai. Tokiu atveju ligos vystymasis gali vykti pagal vieną iš toliau išvardytų „scenarijų“. Panagrinėkime scheminę medžiagų apykaitos kelio diagramą:
E 1 E 2 E 3 E 4
A → B → C → D → P
Medžiaga A dėl nuoseklių fermentinių reakcijų paverčiama produktu P. Esant paveldimam bet kurio fermento, pavyzdžiui, fermento E 3, trūkumui, galimi įvairūs medžiagų apykaitos takų sutrikimai:
Galutinių produktų formavimo pažeidimas.
Šio metabolizmo kelio galutinio produkto trūkumas (nesant alternatyvių sintezės būdų) gali sukelti šiai ligai būdingų klinikinių simptomų atsiradimą.
Klinikinės apraiškos. Kaip pavyzdį apsvarstykite albinizmą. Sergant albinizmu, sutrinka pigmentų – melaninų – sintezė melanocituose. Melaninas randamas odoje, plaukuose, rainelėje ir tinklainės pigmentiniame epitelyje ir turi įtakos jų spalvai. Sergant albinizmu, dėl peršviečiamų kapiliarų pastebima silpna odos pigmentacija, šviesūs plaukai, rausva rainelės spalva. Albinizmo pasireiškimas yra susijęs su fermento tirozino hidroksilazės (tirozinazės), vieno iš fermentų, katalizuojančių melaninų susidarymo metabolizmą, trūkumu.
Pirmtakų substratų kaupimasis.
Jei fermento trūksta, kaupsis tam tikros medžiagos, o daugeliu atvejų kaupsis prieš jas buvę junginiai. Sugedusio fermento substratų – pirmtakų – padidėjimas yra pagrindinė daugelio ligų vystymosi grandis.
Klinikinės apraiškos.Žinoma liga alkaptonurija, kurios metu sutrinka homogentizo rūgšties oksidacija audiniuose (homogentizino rūgštis yra tarpinis tirozino katabolizmo metabolitas). Tokiems pacientams stebimas homogentizinės rūgšties oksidacijos fermento – homogentizo rūgšties dioksigenazės – trūkumas, dėl kurio išsivysto liga. Dėl to padidėja homogentizo rūgšties koncentracija ir jos išsiskyrimas su šlapimu. Esant deguoniui, homogentizo rūgštis virsta juodu junginiu – alkaptonu. Todėl tokių ligonių šlapimas, veikiamas oro, pajuoduoja. Alkaptonas taip pat susidaro biologiniuose skysčiuose, nusėda audiniuose, odoje, sausgyslėse ir sąnariuose. Esant dideliems alkaptono sankaupoms sąnariuose, sutrinka jų mobilumas.
Sutrikęs galutinių produktų susidarymas ir pirmtakų substratų kaupimasis.
Ligos pastebimos tada, kai tiek produkto trūkumas, tiek pradinio substrato susikaupimas sukelia klinikines apraiškas.
Klinikinės apraiškos. Pavyzdžiui, žmonėms, sergantiems Gierke liga (I tipo glikogenoze), tarp valgymų sumažėja gliukozės koncentracija kraujyje (hipoglikemija). Taip yra dėl sutrikusio glikogeno skaidymo kepenyse dėl fermento gliukozės-6-fosfatazės defekto. Tuo pačiu metu tokiems žmonėms padidėja kepenų dydis (hepatomegalija), nes jose susikaupia nepanaudotas glikogenas.
Fermentų taikymas medicinoje
Fermentiniai preparatai plačiai naudojami medicinoje. Fermentai medicinos praktikoje naudojami kaip diagnostinės (enzimodiagnostikos) ir terapinės (enzimoterapijos) priemonės.
Be to, fermentai naudojami kaip specifiniai reagentai daugeliui medžiagų nustatyti. Taigi, gliukozės oksidazė naudojama kiekybiniam gliukozės kiekiui šlapime ir kraujyje nustatyti. Karbamido kiekiui kraujyje ir šlapime nustatyti naudojamas fermentas ureazė. Įvairios dehidrogenazės aptinka tinkamus substratus, tokius kaip piruvatas, laktatas, etanolis ir kt.
Enzimodiagnostika
Fermentinė diagnostika apima ligos (ar sindromo) diagnozę, pagrįstą fermentų aktyvumo nustatymu žmogaus biologiniuose skysčiuose.
Fermentų diagnostikos principai grindžiami šiomis pozicijomis:
1. pažeidžiant ląsteles kraujyje ar kituose biologiniuose skysčiuose (pvz., šlapime), padidėja pažeistų ląstelių viduląstelinių fermentų koncentracija;
2. jo aptikimui pakanka išleisto fermento kiekio;
3. fermentų aktyvumas biologiniuose skysčiuose, nustatytas pažeidžiant ląsteles, yra stabilus pakankamai ilgą laiką ir skiriasi nuo normalios vertės;
4. kai kurie fermentai turi vyraujančią arba absoliučią lokalizaciją tam tikruose organuose (organų specifiškumas);
5. Yra tam tikrų fermentų tarpląstelinės lokalizacijos skirtumų.
Fermentų naudojimas kaip vaistai
Fermentų, kaip terapinių agentų, naudojimas turi daug apribojimų dėl didelio jų imunogeniškumo.
Nepaisant to, fermentų terapija aktyviai plėtojama šiose srityse:
1. pakaitinė terapija – fermentų naudojimas esant jų trūkumui;
2. kompleksinės terapijos elementai – fermentų naudojimas kartu su kita terapija.
Pakaitinė fermentų terapija veiksminga esant virškinimo trakto ligoms, susijusioms su nepakankama virškinimo sulčių sekrecija. Pavyzdžiui, pepsinas vartojamas sergant achilija, hipo- ir anacidiniu gastritu. Kasos fermentų trūkumą taip pat galima didžiąja dalimi kompensuoti vartojant vaistus, kurių sudėtyje yra pagrindinių kasos fermentų (festal, enzistal, mezim-forte ir kt.).
Fermentai naudojami kaip papildomos terapinės priemonės daugeliui ligų. Proteolitiniai fermentai (tripsinas, chimotripsinas) lokaliai naudojami pūlingoms žaizdoms gydyti, siekiant skaidyti negyvų ląstelių baltymus, pašalinti kraujo krešulius ar klampius sekretus sergant uždegiminėmis kvėpavimo takų ligomis. Fermentiniai preparatai plačiai naudojami trombozei ir tromboembolijai. Tam naudojami fibrinolizino, streptoliazės, streptodekazės, urokinazės preparatai.
Hialurono rūgšties skilimą katalizuojantis fermentas hialuronidazė (lidazė) yra naudojamas po oda ir į raumenis randams pašalinti po nudegimų ir operacijų (hialurono rūgštis sudaro kryžminius ryšius jungiamajame audinyje).
Vėžiui gydyti naudojami fermentiniai preparatai. Asparaginazė, katalizuojanti asparagino katabolizmo reakciją, buvo pritaikyta leukemijos gydymui.
Būtina sąlyga antileukeminiam asparaginazės poveikiui buvo leukemijos ląstelėse atrastas sugedęs fermentas asparagino sintetazė, katalizuojanti asparagino sintezės reakciją.
Leukemijos ląstelės negali sintetinti asparagino ir gauti jo iš kraujo plazmos. Jei plazmoje esantis asparaginas sunaikinamas įvedant asparaginazę, leukemijos ląstelėse atsiras asparagino trūkumas ir dėl to sutriks ląstelių metabolizmas ir sustos ligos progresavimas.
Imobilizuoti fermentai yra fermentai, sujungti su kietu pagrindu arba įdėti į polimerinę kapsulę.
Fermentams imobilizuoti naudojami du pagrindiniai metodai:
1. Cheminis fermento modifikavimas.
2. Fizinė fermento išskyrimas inertinėje medžiagoje.
Dažnai lipidų kapsulės – liposomos – naudojamos imobilizuoti fermentus, kurie lengvai prasiskverbia pro membranas ir daro reikiamą poveikį ląstelės viduje.
Imobilizuotų fermentų privalumai:
1. Lengvai atskiriamas nuo reakcijos terpės, todėl fermentą galima panaudoti pakartotinai. Produktas nėra užterštas fermentais.
2. Fermentinis procesas gali būti vykdomas nuolat.
3. Padidėja fermentų stabilumas.
Imobilizuoti fermentai gali būti naudojami analizės ir preparato tikslais. Yra kelių tipų prietaisai, kuriuose analitiniais tikslais naudojami imobilizuoti fermentai – fermentų elektrodai, automatiniai analizatoriai, testavimo sistemos ir kt.
Paruošiamasis imobilizuotų fermentų naudojimas pramonėje:
1. L-aminorūgščių paruošimas naudojant aminoacilazę.
2. Didelės fruktozės sirupų gamyba naudojant gliukozės izomerazę.
Fermentų aktyvumas gali keistis veikiamas įvairių išoriniai veiksniai. Medžiagos, galinčios turėti įtakos fermentų aktyvumui, žymimos kaip fermentų moduliatoriai. Savo ruožtu moduliatoriai skirstomi į dvi grupes:
1. Aktyvatoriai. Jų įtakoje fermentų aktyvumas didėja. Metalo katijonai gali veikti kaip aktyvatoriai. Pavyzdžiui, Na + yra žmogaus seilių liaukų amilazės aktyvatorius.
2. Inhibitoriai. Medžiagos, kurioms veikiant sumažėja fermentų aktyvumas.
Inhibitoriai atstovauja didelė grupė medžiagos, kurios skiriasi slopinamojo veikimo mechanizmu.
Pagal slopinamojo poveikio trukmę inhibitoriai skirstomi į:
· negrįžtamas(kurie, sąveikaudami su fermentu, visam laikui atima fermentinį aktyvumą);
· grįžtamasis(kurie laikinai sumažina fermentų aktyvumą).
Negrįžtamų inhibitorių veikimo mechanizmą galima apibūdinti tokia lygtimi:
Į + E EIn,
Kur EIn– fermento kompleksas su inhibitoriumi, kuriame jis neturi katalizinių savybių.
Paprastai negrįžtami inhibitoriai sąveikauja su aktyvios fermento vietos funkcinėmis grupėmis. Jie kovalentiškai su jais jungiasi ir taip juos blokuoja. Dėl to fermentas praranda gebėjimą sąveikauti su substratu.
Klasikinis negrįžtamų inhibitorių pavyzdys yra fosforas organinės medžiagos. Diizopropilo fluorofosfatas (DFP) jau daugelį metų naudojamas biocheminiuose tyrimuose. Organiniai fosforo junginiai susijungia su serino liekana aktyvioje fermento vietoje:
 |
Fermentai, kurių aktyvioje vietoje yra serino, yra cholinesterazė, tripsinas, elastazė ir kt.
Alkilinimo agentai plačiai naudojami kaip kiti negrįžtami inhibitoriai. Šie junginiai sąveikauja su cisteino arba imidazalo histidino radikalų SH grupėmis aktyvioje vietoje. Jodoacetamido negrįžtamo fermento slopinimo mechanizmas:
Jodoacetamidas, monojodoacetatas ir kt. naudojami kaip alkilinimo agentai kaip negrįžtami inhibitoriai biochemijoje.
Negrįžtamo slopinimo reiškinys naudojamas šalies ūkyje ir medicinoje. Tai yra insekticidų (vabzdžių kontrolės priemonių) ir tam tikrų vaistų (anticholinesterazės vaistų) naudojimo pagrindas. Jų pagrindu buvo sukurtos nervus paralyžiuojančio poveikio cheminės karinės medžiagos iš organinių fosforo junginių grupės.
Skirtingai nuo negrįžtamų inhibitorių, grįžtamieji inhibitoriai sumažina fermentų aktyvumą tik tam tikrą laiką. Jų slopinamojo poveikio mechanizmas gali būti pavaizduotas šių reakcijų lygčių forma:
Į+ E EIn
Į + ES ESIn
Kaip matyti iš pateiktų reakcijų lygčių, grįžtamieji inhibitoriai grįžtamai prisijungia prie fermento arba fermento-substrato komplekso. Tokiu atveju fermentas praranda savo katalizines savybes.
Grįžtamieji inhibitoriai pagal slopinamojo poveikio mechanizmą skirstomi į konkurencingas Ir nekonkurencingas kurie skiriasi vienas nuo kito slopinamojo poveikio fermentui mechanizmu.
Esant nekonkurenciniam slopinimui, inhibitorius grįžtamai prisijungia prie fermento kitoje vietoje nei jo aktyvioji vieta. Tokiu atveju pasikeičia aktyvaus centro konformacija, o tai lemia grįžtamąjį fermento inaktyvavimą. Veikiant konkurenciniam inhibitoriui, fermento afinitetas jo substratui nekinta, t.y. vertė nesikeičia KAM m, tačiau didžiausias fermentinės reakcijos greitis mažėja ( V maks.). Metaboliniai tarpiniai produktai gali veikti kaip nekonkurencingi inhibitoriai.
Konkurencinių inhibitorių molekulės turi tam tikrą panašumą į tikrąjį fermento substratą. Klasikinis konkurencinio inhibitoriaus pavyzdys yra malono rūgštis, kuri grįžtamai sumažina fermento sukcinato dehidrogenazės aktyvumą.
Gintaro rūgštis Malono rūgštis
Iš pateiktų formulių aišku, kad malono rūgštis iš tiesų labai panaši į gintaro rūgštį. Struktūrinis panašumas leidžia malono rūgščiai prisijungti prie aktyvaus fermento sukcinato dehidrogenazės centro. Tačiau šis junginys negali patekti į šio fermento katalizuojamą reakciją (dehidrogenavimo reakciją). Todėl inhibitorius prisitvirtina prie aktyviosios fermento vietos ir taip blokuoja jo sąveikos su tikruoju substratu galimybę. Taigi, veikiant konkurenciniam inhibitoriui, fermento afinitetas substratui smarkiai sumažėja (vertė didėja KAM m), tačiau vertė nesikeičia V maks. Konkurencinio slopinimo reiškinį galima pašalinti staigiai padidinus substrato koncentraciją reakcijos mišinyje.
Taigi, konkurenciniai inhibitoriai, skirtingai nei nekonkurencingi inhibitoriai, jungiasi prie aktyvaus fermento centro, todėl smarkiai padidėja jo vertė. KAM m iki substrato, o tai lemia grįžtamąjį jo aktyvumo sumažėjimą.
Oksalo acto rūgštis veikia kaip fiziologinis konkurencinis sukcinato dehidrogenazės inhibitorius. Kaip matyti iš pateikto paveikslo, šis tarpinis metabolinis produktas taip pat turi tam tikrą struktūrinį panašumą į gintaro rūgštį. Konkurencinis sukcinato dehidrogenazės slopinimas oksalo acto rūgštimi vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant redokso transformacijas mitochondrijose:
Yra ir kitas fermentų aktyvumo reguliavimo būdas - allosterinis reguliavimas. Tai būdinga ypatingai fermentų grupei - allosteriniai fermentai. Alosteriniai fermentai apima oligomerinius baltymus, kurių struktūroje yra reguliavimo (allosteriniai) centrai.
Allosterinių fermentų molekulėse yra dviejų tipų subvienetai:
1) katalizinis(SU);
2) reguliavimo (R).
Katalizinius subvienetus vaizduoja polipeptidinė grandinė, kurioje yra aktyvusis fermento centras. Reguliavimo subvienetai savo struktūroje turi reguliavimo (allosterinį) centrą. Allosterinis centras yra molekulės dalis, kuri gali konkrečiai sąveikauti su fermento reguliatoriumi. Atitinkamai, reguliatoriai gali veikti ir kaip fermento aktyvatoriai, ir inhibitoriai.
Allosterinis reguliatorius jungiasi prie reguliavimo centro dėl jo molekulės sterinio atitikimo alosteriniam centrui. Dėl reguliatoriaus molekulės paviršiaus geometrinio panašumo ir alosterinio centro trimatės struktūros tarp jų atsiranda grįžtama specifinė sąveika. Susidaro kompleksas, kurį stabilizuoja silpnos sąveikos jėgos. Van der Waals pajėgos šiuo atveju yra ypač svarbios. Be jų, stabilizuojant reguliatoriaus kompleksą su allosteriniu centru, dalyvauja vandenilio ryšiai, taip pat hidrofobinė ir elektrostatinė sąveika.
Dėl fermento sąveikos su alosteriniu inhibitoriumi baltymo molekulėje vyksta konformaciniai poslinkiai reguliavimo subvieneto polipeptidinėje grandinėje. Jų atsiradimas turi įtakos sąveikai SU- Ir R-subvienetai. Dėl to katalizinio subvieneto polipeptidinės grandinės konformacija pasikeičia antrą kartą. Tokį pertvarkymą lydi aktyvaus centro struktūros poslinkiai, dėl kurių sumažėja aktyvaus centro afinitetas substratui (padidėja vertė KAM m), kuris lemia fermento slopinimą (33 pav.).
33 pav. Fermento allosterinio slopinimo mechanizmas
Alosterinio inhibitoriaus prijungimas prie alosterinio centro lemia aktyvaus centro konformaciją ant fermento katalizinio subvieneto ir sumažėja jo afinitetas substratui.
Allosterinis slopinimas yra grįžtamas. Komplekso disociacija R-subvienetus su inhibitoriumi lydi pradinės subvienetų polipeptidinių grandinių konformacijos atstatymas, dėl kurio atkuriamas aktyvaus centro afinitetas substratui.
Labai dažnai alosterinių inhibitorių vaidmuo yra reakcijos arba metabolinio kelio, kuriame dalyvauja fermentas, produktas. Fermento slopinimo reakcijos produktu procesas vadinamas retroinhibicija.
Retroinhibicija yra neigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmo, reguliuojančio medžiagų apykaitos procesus ir palaikant homeostazę, pagrindas. Ji užtikrina pastovaus įvairių tarpinių medžiagų apykaitos produktų lygio palaikymą ląstelėse. Retroinhibicijos pavyzdys yra heksokinazės slopinimas reakcijos produktu gliukozės-6-fosfatu:
Kai kuriais atvejais slopinimas atsiranda ne dėl galutinio reakcijos produkto, o dėl galutinio proceso, kurio metu vyksta reakcija, produkto. Fermentų retroinhibicija E proceso produktas P:
kur B, C, D, D yra tarpiniai produktai.
Pateiktoje transformacijų sekoje kaip alosterinis fermento inhibitorius E proceso produktas yra R. Panašus retroinhibicijos mechanizmas plačiai aptinkamas ląstelėse. Pavyzdys yra fermento acetil-CoA karboksilazės, dalyvaujančios aukštesnių riebalų rūgščių sintezėje, slopinimas galutiniu riebalų rūgščių sintezės produktu - palmitino rūgštimi.
Jie panašiai, bet priešingai veikia alosterinius fermentus alosteriniai aktyvatoriai. Jei nėra aktyvatoriaus, fermentas turi mažą afinitetą substratui. Tačiau, kai allosterinis centras susijungia su aktyvatoriumi, katalizinio centro afinitetas substratui didėja, o tai lydi substrato konversijos greičio padidėjimas. Reakcijos substrato molekulė dažnai veikia kaip allosterinis aktyvatorius. Tai turi gilią biologinę prasmę. Sąlygomis, kai substrato kiekis ląstelėje didėja, norint palaikyti pastovią vidinę aplinką, reikia jį sunaikinti. Tai pasiekiama aktyvuojant fermentą, kuris katalizuoja jo konversiją. Tokio aktyvinimo pavyzdys yra gliukokinazės aktyvinimas gliukoze.
Allosteriniai fermentai, kuriuose substratas veikia kaip aktyvatorius, vadinami homotropiniais. Šie fermentai turi kelis tos pačios struktūros substrato surišimo centrus, kurie, priklausomai nuo sąlygų, gali tarnauti ir kaip fermento reguliavimo, ir kataliziniai centrai.
Priešingai nei homotropiniai fermentai, yra heterotropiniai fermentai. Pastaruosius reguliuoja moduliatoriai, kurių struktūra skiriasi nuo pagrindo. Todėl jų struktūra labai skiriasi aktyvus Ir alosterinis centrai.
Labai dažnai tas pats alosterinis fermentas gali sąveikauti su keliais skirtingais moduliatoriais – aktyvatoriais ir inhibitoriais. Pavyzdžiui, fermentas fosfofertokinazė (PPK), kuris katalizuoja šią reakciją:
Šiuo atveju skirtingi moduliatoriai, kaip taisyklė, turi savo surišimo vietas fermento molekulėje.
Homotropinių fermentų kinetika skiriasi nuo neallosterinių fermentų kinetikos. Reakcijos greičio priklausomybės nuo substrato koncentracijos grafikas turi ne hiperbolinę, o sigmoidinę formą (34 pav.).
34 pav. Homotropinių fermentų kinetika
Dėl šios priežasties, norint apskaičiuoti KAM Michaelis-Menten lygtis jiems nepriimtina.
Sigmoidinis alosterinių fermentų kinetikos pobūdis yra susijęs su ypatingu – kooperatyviu atskirų fermentų subvienetų sąveikos su substratu pobūdžiu. Kiekvienos paskesnės substrato molekulės prisijungimas prie surišimo vietos skatina konformacinius pertvarkymus gretimuose subvienetuose, todėl padidėja jų afinitetas substratui.
Izofermentai
Didelę reikšmę užtikrinant veiksmingą medžiagų apykaitos procesų eigą ląstelėse izofermentai. Izofermentai yra genetiškai nulemtos kelios fermento formos, kurios katalizuoja tą pačią reakciją, tačiau turi skirtingą struktūrą ir fizikines bei chemines savybes.
Tipiškas fermentas, kurį atstovauja izofermentai, yra laktato dehidrogenazė (LDH). Šis fermentas katalizuoja tokią reakciją.
Žmogaus kraujo serumo elektroforezė atskleidžia penkias skirtingas baltymų frakcijas kraujyje, kurios gali katalizuoti laktato dehidrogenazės reakciją. Taigi galime prieiti prie išvados, kad yra penki LDH izofermentai (35 pav.).
35 pav. LDH izofermentų pasiskirstymas elektroforerogramoje (elektroforezė atliekama esant pH 6,8)
Didelę reikšmę izofermentų egzistavimo fenomenui paaiškinti turi tai, kad izofermentai randami tik fermentuose – oligomeriniuose baltymuose. Jų molekulė susideda iš mažiausiai dviejų subvienetų.
Kalbant apie LDH, šis fermentas yra tetrameras, t.y. jo molekulėje yra keturi atskiri subvienetai. Yra du skirtingi LDH subvienetų tipai – M tipo (raumenų) ir H tipo (širdies). Subvienetas – polipeptidinė grandinė, kurios struktūrą koduoja atitinkamas genas, nulemiantis izofermentų genetinę prigimtį. Kadangi subvieneto polipeptidai yra skirtingų genų produktai, jie turi:
· skirtinga aminorūgščių sudėtis (pirminė struktūra);
· nevienodos fizinės ir cheminės savybės (elektroforezinis mobilumas);
· sintezės skirtinguose audiniuose ypatumai.
Dėl struktūros skirtumų izofermentai skiriasi ir kinetika (afinitetu substratui), aktyvumo reguliavimo ypatumais, taip pat lokalizacija eukariotinėse ląstelėse bei audinių specifiškumu aukštesniuosiuose organizmuose.
Tetramero sudėtyje gali būti LHD molekulių skirtingi tipai subvienetai skirtingais santykiais. Kai susidaro tetrameras, galimas toks subvienetų derinys:
Dėl šios priežasties paaiškėja būtent penkių LDH izofermentų egzistavimo priežastis: LDH 1 turi minimalų elektroforezinį mobilumą, o LDH 5 – didžiausią.
LDH izofermentų genai skirtinguose audiniuose ekspresuojami skirtingai: širdies raumenyje sintetinamas tik H tipo subvienetas. Todėl čia susidaro tik LDH 1, kurį sudaro tik tokio tipo subvienetai. Kepenyse ir griaučių raumenys Sintetinamas tik M tipo subvienetas. Todėl čia susidaro ir veikia tik LDH 5 izofermentas, susidedantis tik iš M subvienetų. Kituose audiniuose su skirtingu greičiu ekspresuojami genai, koduojantys ir H, ir M subvienetus. Todėl juose gali susidaryti įvairios tarpinės LDH izofermentų formos (LDG 2 – DG 4).
Dėl to, kad subvienetai skiriasi aminorūgščių sudėtis, jie turi skirtingą molekulinę masę ir elektros krūvis. Tai lemia skirtingas jų fizikines ir chemines savybes.
Be fizikinių ir cheminių savybių skirtumų, izofermentai labai skiriasi ir katalizinėmis savybėmis (kinetiniais parametrais: jiems būdingas skirtingas greitis ( V max) ir afinitetas substratui ( KAM m), taip pat jautrumas įvairių reguliatorių veiksmams).
Taigi, LDH turi 1 reikšmę KAM m pieno rūgšties atžvilgiu yra 0,0044 M, tuo tarpu LDH 5 – 0,0256 M. Karbamidas pasižymi slopinančiomis savybėmis prieš LDH 5, bet neturi įtakos LDH 1. Šiuo atveju jis veikia kaip LDH 1 inhibitorius piruvo rūgštis, kuris neturi panašaus poveikio LDH 5 .
Taigi izofermentai išsiskiria struktūra ir savybėmis, o jų egzistavimas nulemtas genetiškai. Tai kelia klausimą dėl izofermentų biologinio pagrįstumo.
Norint suprasti šią problemą, reikia turėti omenyje, kad skirtingose eukariotinės ląstelės dalyse (skyriuose), taip pat skirtinguose daugialąsčio organizmo audiniuose yra skirtingos sąlygos. Juose yra nevienodos tų pačių substratų ir deguonies koncentracijos. Jiems būdingos skirtingos pH vertės ir joninė kompozicija. Todėl skirtingų audinių ląstelėse, taip pat skirtinguose ląstelės skyriuose, skirtingomis sąlygomis iš tikrųjų vyksta tos pačios cheminės transformacijos. Šiuo atžvilgiu leidžia egzistuoti izofermentai, kurių katalizinės ir reguliavimo savybės skiriasi
1) skirtingomis sąlygomis vienodai efektyviai atlikti tuos pačius cheminius virsmus;
2) užtikrinti smulkų katalizinių transformacijų reguliavimą pagal reguliatorių pasiskirstymo atitinkamame ląstelės skyriuje ir skirtinguose audiniuose ypatybes.
Tai galima iliustruoti karbamoilfosfato sintazės citoplazminių ir mitochondrijų izofermentų savybių ypatumais. Šis fermentas katalizuoja karbamoilo fosfato sintezę.
Karbamoilfosfatas, susidaręs mitochondrijose, veikiamas mitochondrijų izofermento, toliau dalyvauja karbamido susidarymo procese, o karbamoilfosfatas, susidaręs veikiant citoplazminiam izofermentui, naudojamas pirimidino nukleotidų sintezei. Natūralu, kad šie fermentai, susiję su visiškai skirtingais medžiagų apykaitos procesais, yra atskirti erdviškai ir turi skirtingas katalizines ir reguliavimo savybes. Jų buvimas vienoje ląstelėje leidžia vienu metu vykti dviem skirtingiems procesams, apimantiems vieno pirmtako naudojimą.
Taigi izofermentų egzistavimas turi svarbią biologinę reikšmę, susijusią su tų pačių fermentinių procesų galimybe vykti skirtingomis sąlygomis ir dėl šios priežasties yra nulemtas genetiškai.
1. Kokie yra fermentų ir nebaltyminių katalizatorių panašumai ir skirtumai?
2. Išvardykite pagrindines fermentų klases ir apibūdinkite jas.
3. Kuo remiasi šiuolaikinė tarptautinė fermentų nomenklatūra?
4. Apibrėžkite reakcijos energijos barjero sąvoką.
5. Kokie yra požiūriai į mechanizmą, kuriuo fermentai mažina reakcijos energijos barjerą?
6. Kokia yra Michaelio konstantos ir didžiausio reakcijos greičio fizikinė reikšmė?
7. Kokiais vienetais matuojama Michaelio konstanta ir didžiausias reakcijos greitis?
8. Kodėl fermentinės reakcijos greitis didėja, kai reakcijos mišinio temperatūra pakyla iki temperatūros optimalumo?
9. Kokius žinote fermentų specifiškumo tipus? Koks yra fermentų specifiškumas?
10. Kodėl fermentų aktyvumas priklauso nuo aplinkos pH? Kurių fermentų aktyvumas labiausiai priklauso nuo šio faktoriaus?
11. Kokius žinote fermentų kiekybinio nustatymo metodus?
12. Kaip matuojamas fermentų aktyvumas?
13. Kokie esminiai skirtumai tarp grįžtamųjų ir negrįžtamųjų inhibitorių?
14. Kas yra konkurenciniai inhibitoriai? Kokius konkurencinius inhibitorius žinote?
15. Koks yra allosterinio slopinimo mechanizmas?
16. Kas tai? biologinis pagrįstumas izofermentų buvimas?
17. Kokius žinote izofermentų frakcionavimo būdus?
6 skyrius. VITAMINAI
Vitaminai vadinamos organinėmis medžiagomis, kurios būtinos nedideliais kiekiais normaliai medžiagų apykaitai užtikrinti ir fiziologines funkcijas, nėra sintetinami organizme ir yra būtini maisto komponentai.
Vitaminų poreikis gyvybinėms organizmo funkcijoms užtikrinti atsiranda dėl to, kad dauguma jų dalyvauja formuojantis kofermentams. Dėl to, kad norint užtikrinti normalią katalizinių procesų eigą, reikalingi labai nedideli kiekiai fermentų, kurie cheminių reakcijų procese taip pat nesuvartojami, vitaminai organizmui reikalingi ir labai mažais kiekiais.
Šiuo metu žinoma daugiau nei 20 vitaminų. Pagrindiniai jų šaltiniai yra:
· gyvūninės ir augalinės kilmės maistas;
storosios žarnos saprofitinė mikroflora;
· provitaminai.
Provitaminai Jie yra vitaminų pirmtakai, iš kurių organizme įvairiais būdais formuojasi aktyvūs vitaminai. Tai yra karotinas (provitaminas A), 7-dehidrocholesterolis (provitaminas D) ir kt.
Be vitaminų, yra speciali grupė į vitaminus panašios medžiagos. Šios medžiagos turi vitaminų savybių, tačiau yra sintezuojamos žmogaus organizme. Tai karnitinas, inozitolis, lipoinė rūgštis, cholinas, pangamo rūgštis, vitaminas U ir kt. Į vitaminus panašios medžiagos pasižymi vitaminų savybėmis atitinkamų rūšių organizmuose.
Kartu su vitaminais yra medžiagų grupė - antagonistai, kurie žymimi terminu antivitaminų. Tai apima medžiagas, kurios turi priešingą poveikį nei vitaminai.
Antivitaminus galima suskirstyti į dvi grupes, priklausomai nuo jų antivitamininio poveikio mechanizmo.
1. Fermentai, naikinantys vitaminus. Šios grupės atstovų pavyzdžiai yra tiaminazė (fermentas, katalizuojantis vitamino B1 transformaciją), askorbato oksidazė (fermentas, katalizuojantis vitamino C transformaciją) ir kt.
2. Medžiagos, kurių struktūra panaši į vitaminus, dėl kurių jos gali užmegzti konkurencinį ryšį su vitaminais dėl bendrų surišimo vietų. Šiai grupei taip pat priklauso vitaminų dariniai (oksitiaminas ir kt.).
Vitaminų poreikis priklauso nuo daugelio skirtingų priežasčių. Tai apima lytį, amžių, sezoną, geografinę platumą, fizinė būklė, darbo pobūdis, sveikatos būklė ir kt.
Tuo atveju, kai pažeidžiamas atitikimas tarp organizmo vitamino poreikio ir jo patekimo į organizmą lygio, atsiranda vitaminų disbalanso būsena. Vitaminų disbalanso apraiškos gali būti:
hipovitaminozė;
· avitaminozė;
· hipervitaminozė.
Hipovitaminozė yra sąlygos, kai vitaminų kiekis organizme mažėja. Yra dvi pagrindinės priežasčių grupės ( išorinis Ir vidinis), dėl kurių jie atsirado.
1. Prie išorinių priežasčių priskiriamos tos, dėl kurių sumažėja organizmo aprūpinimas vitaminais iš maisto (nevalgius, valgant maistą, kuriame yra nedidelis vitaminų kiekis arba netinkamai termiškai apdorotas).
2. Vidinės priežastys yra susijusios su padidėjusiu organizmo vitaminų poreikiu tam tikromis sąlygomis (vaikystė, nėštumas, sunkus fizinis darbas, stresas ir įvairios vidaus ligos) arba su sutrikusiu vitaminų pasisavinimu organizme (su įvairiomis ligomis, susijusiomis su žala virškinimo trakte).
Hipovitaminozė yra gana paplitusi. Jie ypač dažni pavasarį.
Vitaminų trūkumas yra kraštutinė hipovitaminozės forma. Jiems būdingas tam tikrų vitaminų išnykimas iš organizmo. Dažniausiai vitaminų trūkumo priežastis yra nutrūkęs vitaminų patekimas į organizmą su maistu. Šiuo metu ši būklė yra gana reta. Tai gali atsirasti tarp tų žmonių grupių, kurios dirba ekstremaliomis sąlygomis (kariškiai, geologai, jūreiviai ir kt.).
Hipervitaminozė yra sąlygos, kai organizme padidėja vitaminų kiekis. Jų atsiradimo priežastis dažniausiai yra padidėjęs vitaminų suvartojimas su maistu. Hipervitaminozės atsiradimas labiausiai būdingas riebaluose tirpiems vitaminams. Tai gali pasireikšti ilgai vartojant maistą, kuriame gausu tam tikrų vitaminų, taip pat perdozavus vitaminų preparatų.
Vitaminų klasifikacija
Pagrindas Šiuolaikinė klasifikacija Vitaminai priklauso nuo jų tirpumo. Remiantis tuo, visi vitaminai skirstomi į:
· tirpus riebaluose– vitaminai A, D, E, K, F, Q;
· vandenyje tirpus– B grupės vitaminai (B 1, B 2, B 3, B 5, B 6, B 12, B c), taip pat PP, C, H ir rutinas.
Riebaluose tirpūs vitaminai
Šiai vitaminų grupei būdinga daugybė bendrosios savybės:
1. Daugelio riebaluose tirpių vitaminų struktūra apima izopreno molekulių likučius. Jie yra sujungti vienas su kitu tam tikro ilgio grandinėmis, kurios daugiausia lemia riebaluose tirpių vitaminų netirpumą vandenyje ir atvirkščiai - gerą tirpumą organiniuose tirpikliuose:
2. Riebaluose tirpių vitaminų pasisavinimui užtikrinti būtina turėti pakankamą kiekį tulžies rūgštysžarnyne, taip pat pakankamas riebalų, kaip jų tirpiklių, kiekis maiste.
3. Dėl to, kad riebaluose tirpūs vitaminai netirpsta vandenyje, jie pernešami į organizmą krauju, naudojant specialius baltymų nešiklius. Paprastai kiekvieną vitaminą perneša jo nešiklis.
4. Riebaluose tirpūs vitaminai gali kauptis vidaus organų audiniuose. Kepenų audinys dažniausiai tarnauja kaip jų „depas“. Riebaluose tirpių vitaminų vartojimo su maistu nutraukimas iš karto nesukelia hipovitaminozės. Taip yra dėl to, kad organizmas kurį laiką gali juos aprūpinti iš savo „sandėlų“.
5. Dauguma riebaluose tirpių vitaminų neturi kofermentinės funkcijos.
6. Biologinis vaidmuo riebaluose tirpių vitaminų yra dėl to, kad jie turi galimybę reguliuoti genų ekspresiją.
Tačiau, nepaisant tam tikrų panašumų, riebaluose tirpūs vitaminai turi reikšmingų biologinio poveikio pasireiškimo skirtumų.
Vitaminas A
Fermentų aktyvumas ląstelėje nepastovus laiku. Fermentai jautriai reaguoja į situaciją, kurioje atsiduria ląstelė, į ją veikiančius veiksnius tiek išorėje, tiek viduje. pagrindinis tikslas toks fermentų jautrumas – reaguoti į pokyčius aplinką, pritaikyti ląstelę prie naujų sąlygų, tinkamai reaguoti į hormoninius ir kitus dirgiklius, o kai kuriose situacijose – suteikti ląstelei galimybę išgyventi.
Fermentų aktyvumo reguliavimo metodai
Yra keletas būdų, kaip reguliuoti fermentų aktyvumą ląstelėje – vieni metodai tinka bet kokiam fermentui, kiti yra specifiškesni.
1. Substrato arba kofermento prieinamumas
Dirba čia masinio veikimo dėsnis– pagrindinis cheminės kinetikos dėsnis: esant pastoviai temperatūrai, cheminės reakcijos greitis yra proporcingas reaguojančių medžiagų koncentracijos sandaugai. Arba, paprasčiau tariant, greitis, kuriuo medžiagos reaguoja viena su kita, priklauso nuo jų koncentracijos. Taigi, pakeitus bent vieno substrato kiekį, reakcija sustabdoma arba pradedama.
5. Allosterinis reguliavimas
Sukurti allosteriniai fermentai dviejų ar daugiau subvienetų: kai kuriuose subvienetuose yra katalizinis centras, kiti turi allosterinį centrą ir yra reguliuojantys. Efektoriaus prijungimas prie allosterinio (reguliacinio) subvieneto keičia baltymo konformaciją ir atitinkamai katalizinio subvieneto aktyvumą.
Alosteriniai fermentai dažniausiai atsiranda medžiagų apykaitos takų pradžioje, o daugelio vėlesnių reakcijų eiga priklauso nuo jų aktyvumo. Todėl jie dažnai vadinami pagrindiniai fermentai.
Galutinis biocheminio proceso metabolitas arba šios reakcijos produktas gali veikti kaip neigiamas reguliatorius, t.y. jis įsijungia neigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmas. Jei reguliatoriai yra pradinis reakcijos metabolitas arba substratas, mes kalbame apie tiesioginis reguliavimas, jis gali būti teigiamas arba neigiamas. Biocheminių kelių metabolitai, kažkaip susiję su šia reakcija, taip pat gali būti reguliatoriai.
Fosfofruktokinazės reguliavimas pagal galutinį produktą
Pavyzdžiui, fermentas, skirtas gliukozės energijos skaidymui, fosfofruktokinazė, reguliuoja tarpiniai ir galutiniai šio skirstymo produktai. Tuo pačiu metu ATP citrinos rūgštis, fruktozė-1,6-difosfatas yra inhibitoriai, o fruktozė-6-fosfatas ir AMP yra fermentų aktyvatoriai.
Kitas pavyzdys: daugumoje kūno ląstelių (išskyrus kepenis) reguliuojant cholesterolio sintezę alosteriniu inhibitoriumi pagrindinis fermentasšis procesas HMG-CoA reduktazė atsiranda pats cholesterolis, kuris greitai ir tiksliai reguliuoja jo kiekį.
2. Kitas baltymų ir baltymų sąveikos pavyzdys gali būti aktyvumo reguliavimas baltymų kinazė A per asociacijos-disociacijos mechanizmas.
Baltymų kinazė A yra tetramerinis fermentas, susidedantis iš 2 katalizinių (C) ir 2 reguliavimo (R) subvienetų. Baltymų kinazės A aktyvatorius yra cAMP. CAMP prijungimas prie fermento reguliavimo subvienetų sukelia jų pasitraukimą iš katalizinių subvienetų. Suaktyvinami kataliziniai subvienetai.
Baltymų kinazės A aktyvinimas cAMP
7. Kovalentinė (cheminė) modifikacija
Kovalentinis modifikavimas apima grįžtamąjį tam tikros grupės pridėjimą arba pašalinimą, taip pakeičiant fermento aktyvumą. Dažniausiai tokia grupė yra fosforo rūgštis, rečiau metilo ir acetilo grupės. Fermento fosforilinimas vyksta serino ir tirozino liekanose. Fosforo rūgštis į baltymus pridedama fermentais baltymų kinazės, padalijimas - baltymų fosfatazės.
Fermentų aktyvumo pasikeitimas
fosforilinimo-defosforilinimo metu
Fermentai gali būti aktyvūs abiejuose fosforilintas, ir į defosforilintas sąlyga.
Pavyzdžiui, raumenų fermentuose glikogeno fosforilazė Ir glikogeno sintazė
- adresu apkrova yra fosforilinami, o glikogeno fosforilazė tampa aktyvi ir pradeda skaidyti glikogeną bei deginti gliukozę, o glikogeno sintazė yra neaktyvi.
- metu poilsis Glikogeno sintezės metu abu fermentai defosforilinami, sintazė tampa aktyvi, o fosforilazė tampa neaktyvi.
Fermentų aktyvumo keitimas yra greičiausias būdas paveikti reakcijos greitį. Fermento aktyvumą veikia fizikiniai veiksniai (temperatūra, šviesa, slėgis ir kt.), šių veiksnių veikimas daugeliu atvejų yra nespecifinis. Cheminiai veiksniai specifiškai veikia fermentų aktyvumą. Čia galima išskirti keletą atvejų. Pirma, faktorius gali prisijungti prie aktyvios fermento vietos, o tai dažniausiai lemia katalizinio aktyvumo praradimą. Pats substratas gali veikti taip, jei nėra jokių reakcijai įvykti būtinų veiksnių, arba aktyvų fermento centrą gali blokuoti kitas agentas konkurencinio slopinimo atveju. Antra, veikiant kitam fermentui gali įvykti cheminė fermento modifikacija.
Subtiliausias ir plačiausiai paplitęs fermentų aktyvumo reguliavimo būdas yra allosterinis reguliavimas . Šiuo atveju reguliavimo faktorius jungiasi ne su fermento kataliziniu centru, o su kita jo dalimi ( reguliavimo centras), dėl to pasikeičia fermentų aktyvumas. Taip reguliuojami fermentai vadinami alosterinis, jie dažnai užima pagrindinę vietą metabolizme. Medžiaga, kuri jungiasi su reguliavimo centru, vadinama efektorius , efektorius gali būti inhibitorius , gal būt aktyvatorius Paprastai efektoriai yra arba galutiniai biosintezės takų produktai (grįžtamojo ryšio slopinimas), arba medžiagos, kurių koncentracija atspindi ląstelių metabolizmo būseną (ATP, AMP, NAD+ ir kt.). Paprastai alosteriniai fermentai katalizuoja vieną iš reakcijų, kurios pradeda kai kurių metabolitų susidarymo procesą. Paprastai šis etapas apriboja viso proceso greitį. Kartu su kataboliniais procesais ATP sintezė iš ADP, pats galutinis produktas, ATP, dažnai veikia kaip alosterinis vienos iš ankstyvųjų katabolizmo stadijų inhibitorius. Vienos iš ankstyvųjų anabolizmo stadijų alosterinis inhibitorius dažnai yra galutinis biosintezės produktas, pavyzdžiui, kai kurios aminorūgštys. Pavyzdžiui, alosterinis fermentas yra treonino deaminazė, fermentas, katalizuojantis pirmąjį izoleucino biosintezės etapą iš treonino; izoleucinas yra šio fermento inhibitorius (31 pav.). Tai tipiškas grįžtamojo ryšio slopinimo pavyzdys.
Ryžiai. 31. L-izoleucino biosintezės reguliavimo neigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmu schema:
F1- allosterinis fermentas treonino deaminazė, F2 – F5– fermentai, katalizuojantys tarpines izoleucino biosintezės stadijas. Rodyklė rodo treonino deaminazės slopinimą L-leucinu, galutiniu šio biosintezės kelio produktu.
Kai kurių alosterinių fermentų aktyvumą skatina specifiniai aktyvatoriai. Pavyzdžiui, alosterinis fermentas, reguliuojantis vieną iš katabolinių reakcijų sekų, gali būti veikiamas teigiamų efektorių – ADR arba AMP – stimuliuojančio poveikio ir neigiamo efektoriaus – ATP – slopinamojo poveikio. Taip pat pasitaiko atvejų, kai alosterinis metabolizmo kelio fermentas specifiniu būdu reaguoja į kitų medžiagų apykaitos kelių tarpinius ar galutinius produktus. Dėl to galima koordinuoti įvairių fermentų sistemų veikimo greitį.
