Энэ арга нь видео камер бүхий флюресцент микроскоп дээр суурилуулсан биологийн сорьцоос өөр өөр гэрэлтэй, салангид флюресцент цэгүүдийн багц болох сүүлт одтой төстэй биетүүд болох "сүүлт од" дүрсийг компьютерт оруулахаас бүрдэнэ. Дараа нь тэд зурган дээрээс эдгээр "сүүлт одуудыг" хайж, "толгой" ба "сүүл" -ийн хилийн тодорхойлолтоор тэдгээрийн тоймыг тодруулж, микроскопийн морфометрийг хийдэг. Зурган дээрх "сүүлт од"-ыг хайхын өмнө зургийн гэрэлтүүлгийн түвшинг оновчтой болгож, "сүүлт од"-ын цэгүүдийг тус тусад нь бүдгэрүүлсэн хэсгүүдэд нэгтгэхийн тулд бага нэвтрүүлэх шүүлтүүрийг хийдэг. Дараа нь үүссэн зургийг гэрэлтүүлгийн босго дээр үндэслэн сегментчилж, арын дэвсгэрээс офсет гэж тодорхойлсон, "сүүлт од" -ын контурыг "үрээр" дүүргэх замаар олдог, үр нь дурын цэг юм. "Сүүлт од" -ын толгойн төвийг хамгийн ихдээ ойрхон гэрэлтэх эрч хүчтэй цэгүүдийн хүндийн төвийг тодорхойлох замаар олно. "Толгой" ба "сүүл" -ийн виртуал хил хязгаарыг тодорхойлохдоо сүүлт одны толгойн урд хэсэгт байрлах цэгүүдийн гэрлийн эрчмийн тархалтыг толин тусгал хийх замаар, дараа нь "сүүлт од" -ын микроскопийн морфометрийг хэмжих замаар гүйцэтгэнэ. "сүүлт од", "сүүл" -ийн урт, "толгой" диаметр. Дараа нь бүхэл бүтэн "сүүлт", "сүүл" дэх ДНХ-ийн хувь хэмжээ, ДНХ-ийн гэмтлийн хэмжүүрийг тооцоолно. Жагсаалтад орсон үйлдлүүд нь бүх "сүүлт одууд" дээр нэгэн зэрэг автоматаар хийгддэг. Техникийн үр дүн нь "сүүлт од" зургийг боловсруулах, дүн шинжилгээ хийх нарийвчлал, хурдыг нэмэгдүүлэх явдал юм.

Биологийн бэлдмэлд "ДНХ-ийн сүүлт од" аргаар (сүүлт одны шинжилгээ эсвэл нэг эсийн гель электрофорез - SCGE) олж авсан сүүлт одтой төстэй объектын зургийг боловсруулах, шинжлэх арга нь "сүүлт од" -ын дүрсийг боловсруулах, шинжлэх салбарт хамаарна. хүрээлэн буй орчны янз бүрийн хүчин зүйлийн нөлөөгөөр ДНХ молекулын гэмтлийн түвшинг тодорхойлох, нэг эсийн түвшинд ДНХ молекулын засварыг судлах, биоанагаах ухааны чиглэлээр морфометрийн судалгааны процессыг компьютержуулах (автоматжуулах) зорилготой юм. геномын салшгүй нэгдмэл байдлыг үнэлэх, цацраг туяа эмчилгээ хийлгэж буй хорт хавдартай өвчтөнүүдийн бие даасан цацрагт мэдрэмтгий байдлыг тодорхойлох, далайн эргийн усны биоиндикатор, өөрөөр хэлбэл хүрээлэн буй орчны мутаген хүчин зүйлээс үүдэлтэй ДНХ-ийн олон төрлийн гэмтлийг хянах.

"Сүүлт од" -ын зургууд нь задарсан нэг эсийн гель электрофорезын аргаар ("ДНХ-ийн сүүлт од" арга) олж авсан өөр өөр тод гэрэлтсэн, салангид флюресцент цэгүүдийн багц юм, тиймээс тэдгээрийг зурагт зориулсан аргаар боловсруулж, шинжлэх боломжгүй юм. энгийн (хатуу) объектуудын.

Одоогийн байдлаар "ДНХ-ийн сүүлт од" -ын зургийг флюресценцийн микроскопоор нүдээр харж, ДНХ-ийн гэмтлийн зэрэгээр ялгах эсвэл компьютерийн дүрс боловсруулах хэрэгслийг ашиглан шинжилж байна.

Харааны шинжилгээгээр (Struwe M, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. Фото сүүлт одны шинжилгээ - In vitro фотогенотоксик чанарыг тодорхойлох хурдан скрининг. // Мутацийн судалгаа / Генетик токсикологи ба хүрээлэн буй орчны мутагенез. 2007, 632 ( 1-2), х.44-57) "ДНХ-ийн сүүлт одуудыг" харгалзах үзүүлэлтээр ердийн таван төрөлд ангилдаг. тоон утга 0-ээс 4. ДНХ-ийн гэмтлийн зэрэг нь томьёогоор тодорхойлогддог “ДНХ сүүлт од” индекс (I ДНХ)-ээр илэрхийлэгдэнэ.

Мөн ДНХ =(0n 0 +1n 1 +2n 2 +3n 3 +4n 4)/ ,

Энд n 0 -n 4 нь төрөл тус бүрийн "ДНХ-ийн сүүлт одны" тоо бөгөөд тоологдсон "ДНХ-ийн сүүлт од"-ын нийлбэр юм.

Энэхүү боловсруулалт, дүн шинжилгээ хийх арга нь маш их хөдөлмөр шаарддаг, субъектив бөгөөд "ДНХ-ийн сүүлт од" -ыг ялгах таван түвшний зэрэгтэй тул нарийвчлал багатай тул үр дүнгийн найдвартай байдал багатай байдаг.

Санал болгож буй техникийн шийдэлд хамгийн ойр байгаа нь SCGE-Pro программ хангамжид хэрэгжсэн "ДНХ сүүлт одны" дүрсийг компьютерт шинжлэх арга юм (Сүүлт одны шинжилгээнд зориулсан Chaubery R.C. Компьютержсэн зургийн шинжилгээний программыг үзнэ үү. Methods In Molecular Biology 2005; 291:97). -106), эх загвар болгон баталсан. "Сүүлт од" -ыг шинжлэх энэ арга нь хөдөлмөр бага шаарддаг бөгөөд ялангуяа шаардлагатай байдаг объектив үнэлгээтэдгээрийн параметрүүд (жишээлбэл, "сүүлт одны урт", "сүүлний урт", "толгойн диаметр", "толгой" эсвэл "сүүл" дэх ДНХ-ийн хувь гэх мэт), Эдгээр нь судлагдсан эсийн ДНХ-ийн гэмтлийн түвшинг тодорхойлдог үзүүлэлт болгон ашигладаг. Энэ арга нь зурган дээрх "сүүлт одуудыг" олж, тэдгээрийн параметрүүдийг гараар болон автоматаар тооцоолох боломжийг олгодог.

Энэхүү мэдэгдэж буй аргын сул тал нь тэгш өнцөгт талбайг ашиглан "сүүлт од" -ын хил хязгаарыг тодорхойлох арга бөгөөд энэ тохиолдолд ДНХ-ийн гэмтлийг үнэлэхэд шаардлагатай параметрүүдийг тооцоолох нарийвчлалыг бууруулдаг (ялангуяа гэмтэл нь сул илэрхийлэгдсэн бол). Ойролцоох интерференцийг мөн сүүлт одтой холбож болно. Нэмж дурдахад энэхүү шинжилгээний аргын тусламжтайгаар "толгой" ба "сүүл" -ийн хилийг "сүүлт" тэнхлэгт перпендикуляр шулуун шугамаар тодорхойлж, сүүлт одыг "толгой", "сүүл" гэж хуваадаг. "Сүүлт одны сүүл" -ийн урт, "толгой" ба "сүүл" дэх ДНХ-ийн агууламжийн хувийг тооцоолох нарийвчлалыг ихээхэн бууруулдаг.

Шинэ бүтээлийн техникийн үр дүн нь "ДНХ-сүүлт од" -ын аргаар олж авсан "сүүлт од" -ын дүрсийг боловсруулах, дүн шинжилгээ хийх нарийвчлал, хурдыг нэмэгдүүлэх, түүний дотор "сүүлт од" -ыг шүүх, сегментлэх, тэдгээрийн хил хязгаарыг тодорхойлох замаар тэдгээрийн контурыг тодруулах явдал юм. "толгой" ба "сүүл" нь микроскопийн морфометрийн үр дүнгийн найдвартай байдлыг нэмэгдүүлэх боломжийг олгодог бөгөөд энэ нь хүрээлэн буй орчны янз бүрийн мутаген хүчин зүйлээс үүдэлтэй ДНХ-ийн гэмтлийг хянах явцад биометрийн судалгааны процессыг компьютержуулахад шаардлагатай.

Техникийн үр дүнд "ДНХ-сүүлт од" аргаар олж авсан сүүлт одтой төстэй биетүүдийн дүрсийг боловсруулах, шинжлэх арга нь сүүлт одтой төстэй биетүүд болох "сүүлт од" бүхий дүрсийг оруулсан явдал юм. Флюресцент микроскоп дээр суурилуулсан биологийн сорьцоос компьютерт өөр өөр гэрэл гэгээтэй нэгтгэсэн, салангид флюресцент цэгүүдийг дүрсэлсэн видео камертай, зураг дээрх эдгээр "сүүлт одуудыг" хайж, тэдгээрийн хил хязгаарыг тодорхойлж, тэдгээрийн контурыг тодруулна уу. "толгой" ба "сүүл" микроскопийн морфометрийг хийж, зурган дээрх "сүүлт од" -ыг хайхаасаа өмнө "сүүлт од" -ын бие даасан цэгүүдийг бүдгэрсэн хэсгүүдэд нэгтгэхийн тулд зургийн гэрэлтүүлгийн түвшинг оновчтой болгож, бага давтамжийн шүүлтүүрийг гүйцэтгэнэ. , дараа нь үүссэн зургийг арын дэвсгэрээс офсет гэж тодорхойлсон гэрэлтүүлгийн босго дээр үндэслэн сегментчилэх, хязгаарлагдмал талбайг "үрээр дүүргэх" замаар "сүүлт од" -ын контурыг олох, "сүүлт од" бүрийн төв "толгой" -ыг олох. , хамгийн ихдээ ойр гэрэлтэх эрчимтэй цэгүүдийн хүндийн төвийг тодорхойлох, "толгой" ба "сүүл"-ийн виртуаль хил хязгаарыг тодорхойлох, сүүлт одны урд хэсэгт байрлах цэгүүдийн гэрэлтэлтийн эрчмийн тархалтыг толин тусгал болгох замаар толгой", дараа нь микроскопийн морфометрийг "сүүлт од" хийх замаар: "сүүлт од", "сүүл", "толгойн" диаметрийг хэмжиж, "сүүлт", "сүүл дэх" ДНХ-ийн эзлэх хувийг тооцоолно. ", ДНХ-ийн гэмтлийн хэмжүүрүүд болон шийдэгдэж буй асуудлаас хамааран ДНХ-ийн гэмтлийн зэргийг тодорхойлдог бусад олон үзүүлэлтүүд, жагсаасан үйлдлүүд нь зураг эсвэл цуврал зургийн бүх "сүүлт од" дээр нэгэн зэрэг автоматаар хийгддэг.

Энэ аргыг дараах процедурын дарааллаар гүйцэтгэнэ.

1. Видео камер бүхий флюресцент микроскоп дээр суурилуулсан биологийн сорьцоос компьютерт оруулах, сүүлт одтой төстэй биетүүд - "сүүлт одууд" нь өөр өөр тод гэрэлтдэг флюресцент цэгүүдийн нэгдэл юм.

2. Зургийн тод байдлын түвшинг оновчтой болгох. Тэг тод байдал нь арын дэвсгэр, хамгийн их тод байдал нь "сүүлт од" толгойн төв юм.

3. Дундаж "сүүлт од"-ын радиусын 1/10-тай тэнцэх том радиустай бага нэвтрүүлэх Гауссын шүүлтүүрийг (бүдэгрүүлэх) "сүүлт од" -ын бие даасан цэгүүдийг бүдэгрүүлсэн хэсгүүдэд нэгтгэх зорилгоор гүйцэтгэдэг. Бие биедээ ойрхон байрлах сүүлт одуудыг нэгтгэхээс урьдчилан сэргийлэхийн тулд бүдгэрүүлэх радиусын тохируулга нь интерактив байдлаар ашиглагддаг.

4. Үүссэн бүдэгрүүлсэн хэсгүүдийн сегментчлэлийг гэрэлтүүлгийн босго дээр үндэслэн гүйцэтгэнэ. Босгыг арын дэвсгэрээс офсет байдлаар автоматаар тодорхойлдог (зураг дээр "сүүлт од"-оос өөр гадны орц, объект байхгүй), харин босгыг интерактив байдлаар тохируулах боломжтой.

5. "Сүүлт од"-д хамаарах дурын цэг гэж ойлгогдох хязгаарлагдмал талбайг "үрээр" дүүргэх замаар "сүүлт од"-ын контурыг олох.

"Сүүлт одны толгой" төвийг олох. "Сүүлт од" цэгүүдийн гэрлийн эрчмийг хамгийн их хуваарилах замаар тодорхойлох хоёр аргыг ашиглаж болно. хэвтээ тэнхлэгэсвэл хамгийн ихдээ 80%-иас дээш гэрэлтэх эрч хүч бүхий цэгүүдийн хүндийн төвийн дагуу.

"Сүүлт одны толгой" урд хэсэгт байрлах цэгүүдийн гэрэлтэлтийн эрчмийн тархалтыг толин тусгах замаар "толгой" ба "сүүл" -ийн виртуал хил хязгаарыг тодорхойлох (урд хэсэг нь "сүүлт одны урд талын хил хүртэлх хэсэг юм"). толгой").

"Сүүлт од" -ын микроскопийн морфометрийг "сүүлт одны урт", "сүүлний урт", "толгойн" диаметр зэргийг хэмжиж, "сүүлт", "сүүл дэх" ДНХ-ийн эзлэх хувийг тооцоолох. ”, ДНХ-ийн гэмтлийн хэмжүүрүүд болон шийдэгдэж буй асуудлаас хамааран ДНХ-ийн гэмтлийн зэрэглэлийг тодорхойлдог бусад олон үзүүлэлтүүд.

9. Сүүлт од бүрийн олж авсан параметрүүдийн утгыг хэрэглэгчийн даалгаврыг хэрэгжүүлэхийн тулд MS EXCEL хүснэгтэд гаргадаг, жишээлбэл, цааш нь Статистикийн дүн шинжилгэээсвэл ДНХ-ийн бүтцэд гэмтэл учруулах зэргээр "сүүлт од"-ын ангилал.

Тиймээс, санал болгож буй аргын хувьд сүүлт одны талбай бүрийг нарийн төвөгтэй контураар тодорхойлдог бөгөөд энэ нь "сүүлт од" -ын хилийг тэгш өнцөгт хэлбэрээр тодорхойлдог мэдэгдэж буй аргаас ялгаатай нь параметрүүдийг тооцоолох нарийвчлалыг нэмэгдүүлдэг. талбай, энэ нь хохирлыг үнэлэхэд шаардлагатай параметрүүдийг тооцоолох нарийвчлалыг бууруулдаг (ялангуяа гэмтэл нь сул илэрхийлэгддэг бол) "ДНХ-ийн сүүлт од", учир нь энэ тохиолдолд ойролцоо байрлах хөндлөнгийн оролцоог "сүүлт од" гэж ангилж болно. Нэмж дурдахад мэдэгдэж буй аргад "толгой" ба "сүүл" -ийн хилийг сүүлт одны тэнхлэгт перпендикуляр шулуун шугамаар тодорхойлж, сүүлт одыг "толгой", "сүүл" гэж хуваадаг. Санал болгож буй арга нь "сүүлт одны толгой" -ын төвийг тооцоолж, "сүүлт одны толгой" -ын урд хэсэгт байрлах цэгүүдийн гэрэлтүүлгийн эрчмийг хуваарилах замаар тодорхойлсон виртуал хил хязгаарыг ашигладаг. Энэ нь сүүлт одны сүүлний урт, "толгой, сүүл" дэх ДНХ-ийн хувийг тооцоолох нарийвчлалыг ихээхэн нэмэгдүүлдэг.

Дээрх бүх үйлдлүүд нь зураг эсвэл цуврал зургийн бүх "сүүлт од" дээр нэгэн зэрэг автоматаар хийгддэг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй.

Нэхэмжлэх

"ДНХ-сүүлт од" аргаар олж авсан сүүлт одтой төстэй биетүүдийн зургийг боловсруулах, шинжлэх арга бөгөөд энэ нь сүүлт одтой төстэй биетүүд - "сүүлт од" -ын тусламжтайгаар дүрсийг оруулахаас бүрддэг бөгөөд энэ нь өөр өөр флюресцент цэгүүдийн багц юм. Гэрэлтүүлэг, эдгээр "сүүлт одуудыг" зураг дээрээс хайж олох, "толгой" ба "сүүл"-ийн хил хязгаарыг тодорхойлох замаар тэдгээрийн контурыг тодруулж, микроскопийн морфометрийн шинжилгээг хийх бөгөөд энэ нь зураг дээрх "сүүлт од" хайхаас өмнө дүрсийг оновчтой болгох замаар тодорхойлогддог. "Сүүлт од" -ын бие даасан цэгүүдийг бүдэгрүүлсэн хэсгүүдэд нэгтгэхийн тулд зургийн тод байдлын түвшин, бага давтамжийн шүүлтүүрийг ашиглан "сүүлт од" -ын контурыг олохын тулд арын дэвсгэрээс офсет гэж тодорхойлсон гэрэлтүүлгийн босго дээр үндэслэн үүссэн зургийг сегментчилнэ. ” үр нь “сүүлт од” хамаарах дурын цэг болох “үрээр” хязгаарлагдмал талбайг дүүргэж, гэрэлтэх эрчимтэй цэгүүдийн хүндийн төвийг тодорхойлох замаар “сүүлт од” бүрийн толгойн төвийг олох. дээд талдаа ойртож, сүүлт одны толгойн урд хэсэгт байрлах цэгүүдийн гэрлийн эрчмийн тархалтыг толин тусгах замаар "толгой" ба "сүүл" -ийн виртуал хил хязгаарыг тодорхойлж, дараа нь уртыг хэмжих замаар "сүүлт од" -ын микроскопийн морфометрийг гүйцэтгэнэ. "Сүүлт од", "сүүл", "толгой" диаметр, "сүүл" дэх ДНХ-ийн эзлэх хувь, ДНХ-ийн гэмтлийн хэмжүүрийг тооцоолох ба дээрх үйлдлүүд автоматаар хийгддэг. нэгэн зэрэг бүх "сүүлт одууд" дээр ” цуврал зураг дээр.

Нэг эсийн гель электрофорезийн арга буюу ДНХ-ийн сүүлт одны арга нь өндөр мэдрэмжтэй бөгөөд өндөр найдвартай үр дүнг өгдөг бөгөөд үүний зэрэгцээ гүйцэтгэхэд харьцангуй хялбар бөгөөд хурдан бөгөөд олон улсад стандартчилагдсан (OECD No489). Энэ арга нь дараахь асуудлыг шийдвэрлэхэд хамгийн ирээдүйтэй арга юм.

Хүн ба хүрээлэн буй орчны биомониторинг, өөрөөр хэлбэл ксенобиотик (эм, хүнсний нэмэлт, пестицид, үнэртэй ус, гоо сайхны бүтээгдэхүүн, гэр ахуйн химийн бодис, түүнчлэн ус, агаар, үйлдвэрлэлийн хамгийн өргөн тархсан бохирдуулагчид) -тай харьцах үед үүссэн мутагенезийн үр дагаврыг тодорхойлох. аюул, наноматериал);

онкологийн судалгаа;

ДНХ-ийн засварын системийн судалгаа;

Энэ арга нь стандарт шилэн слайд дээр нимгэн агароз гель дотор хаагдсан бие даасан задарсан эсүүдийн ДНХ ба/эсвэл гэмтсэн ДНХ-ийн хэсгүүдийн тогтмол цахилгаан талбарт янз бүрийн хөдөлгөөнийг бүртгэхэд суурилдаг. Энэ тохиолдолд эсийн ДНХ нүүж, параметрүүд нь ДНХ-ийн гэмтлийн зэргээс хамаардаг "сүүлт сүүл"-тэй төстэй электрофоретик ул мөр үүсгэдэг. Электрофорез дууссаны дараа слайдыг будаж, флюресцент микроскоп ашиглан шинжилнэ.

Зураг авах, өгөгдөл боловсруулах ажлыг микроскоптой хослуулсан өндөр мэдрэмжтэй камер, тусгай программ хангамжийг багтаасан техник хангамж, програм хангамжийн цогцолбор ашиглан гүйцэтгэдэг.

Энэхүү цогцолборт багтсан бүх нийтийн ухаалаг програм хангамж нь:

ДНХ-ийн сүүлт одны зургийн шинжилгээний автоматжуулалт нь "нэг товчлуураар" хэмжилтийн бүх үндсэн параметрүүдийг багтаасан болно % Сүүлт одны сүүл дэх ДНХ;

- өндөр давтагдах чадвар;

ДНХ-ийн сүүлт одны параметрүүдийн шинжилгээг "бодит цаг хугацаанд" болон хадгалсан дижитал зургуудаас хоёуланг нь хийдэг;

Хөтөлбөр нь олон улсын GLP шаардлагын дагуу өгөгдлийг боловсруулж, протокол хэлбэрээр харуулдаг;

Өгөгдлийн шинжилгээ, харьцуулалт;

Хөтөлбөр нь бүрэн баталгаажсан бөгөөд олон улсын GLP шаардлагад нийцдэг. Шаталсан хандалт, өгөгдөл хамгаалах системтэй.

Иж бүрдэлд дараахь зүйлс орно.

1. Флюресцент анагаах ухаан, биологийн микроскоп Nikon Eclipse Ni-E.

2. 50Вт чадалтай эпи-флюресцент гэрэлтүүлгийн систем, DAPI, FITC, TRITC будагч бодисуудад зориулсан шүүлтүүр-дихроик толь шүүлтүүрийн иж бүрдэл.

3. Гэрэлтүүлэх зориулалттай Monochrome CCD IEEE1394 FireWire видео камер. Basler Scout scA1300-32fm. Пикселийн хэмжээ - 3.75 мкм x 3.75 мкм. Нарийвчлал - 1296 px x 966 px. Мэдрэгчийн хэмжээ 1/3 инч. Матриц - Sony. Өндөр хурдны портоор өгөгдөл дамжуулах - 1394 BUS. Хамгийн дээд нарийвчлалтай фрэймийн дэлгэцийн хурд 32 кадр/сек байна. Бодит цаг хугацаанд объектуудтай ажиллах боломжийг олгодог

4. Comet Assay IV - Microsoft Excel-д зориулсан хүснэгт үүсгэгчтэй Windows-д зориулсан програм хангамжийн багц, монохром CCD IEEE1394 FireWire видео камертай бодит цаг хугацаанд ажиллах боломжтой (хэмжилт, дүн шинжилгээг видео бичлэг болон гэрэл зураг дээр хийх боломжтой), ашиглалтын заавар болон Програмыг суулгах, баталгаажуулах CD.

5. Дөрвөн хэрэглэгчдэд нэг жилийн хугацаатай лиценз.

6. Алсын зайн сургалтдөрвөн хэрэглэгчийн интернетээр дамжуулан.

Нэмэлт санал болгож байна:

1. Мэдээллийн оператор нь мэдээллийн сангийн XML хувилбарт Comet Assay IV-ийг ашиглан хайлт хийх, өгөгдөл задлах, аюулгүй Oracle мэдээллийн сангаар дамжуулан MS Excel форматаар хадгалах, хүснэгтэд ажиллахад ашиглах. Автоматаар хадгалсан зураг, гарын үсэг, архивлагдсан өгөгдөл, автомат аудитын өгөгдлийг харах боломжтой. Нэмж дурдахад гарын үсэг зураагүй болон тоон гарын үсэгтэй өгөгдлийг XML формат руу экспортлох боломжийг багтаасан болно. Төрөл бүрийн форматаар тоон гарын үсэгтэй өгөгдлийг үзэхэд зориулсан Crypto-Key-Prov багтсан.

2. GLP системийн хандалтын менежер. Access Manager нь мэдээллийн санд хандах хандалтыг хянах, удирдахад зориулагдсан програм юм. PI генетикийн хор судлалын нэгдсэн систем. Системийн иж бүрэн аудитыг багтаасан болно. Гадаад аудит. Програм, хандалт, нууц үг, аудит гэх мэт хэрэглэгчийн бүртгэл, хэрэглэгчийн үйл ажиллагааг удирдах. Хэрэглэгчид болон аудитын өгөгдлийг найдвартай хамгаалахын тулд Oracle-г ашигладаг. FDA 21 CFR 11-р хэсгийн цахим бүртгэл, цахим гарын үсгийн эцсийн дүрмийг бүрэн дагаж мөрдөх.

3. Их Британи дахь Perceptive хэрэгслүүдийн үндсэн дээр нэг хэрэглэгчийг сургах

Улсын ариун цэврийн болон эпидемиологийн
ОХУ-ын норм

Генотоксик шинж чанарын үнэлгээ
ДНХ-ийн сүүлт одны аргаin vitro

MP 4.2.0014-10

Москва 2011 он

1. Боловсруулсан: Эм зүйн эрдэм шинжилгээний хүрээлэнгийн нэрэмжит. V.V. Закусова РАМС, Москва (RAMS-ийн корреспондент гишүүн, профессор, анагаахын шинжлэх ухааны доктор, А.Д. Дурнев, биологийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигч А.К. Жанатаев); Оросын ШУА-ийн онолын болон туршилтын биофизикийн хүрээлэн, Пущино, Москва муж (Н.П. Сирота); Экологийн тоног төхөөрөмж, эко хүнсний "DIOD" нээлттэй хувьцаат компани, Москва (ОХУ-ын Байгалийн шинжлэх ухааны академийн академич, доктор В.П. Тихонов, доктор Т.В. Шевченко, доктор И.А. Родина, К.Л. Плигина).

2. Хэрэглэгчийн эрхийг хамгаалах, хүний ​​сайн сайхны төлөөх хяналтын холбооны албаны дарга Г.Г. Онищенко 2010 оны 10-р сарын 14

3. Анх удаа танилцуулж байна.

4.2. ХЯНАЛТЫН АРГА. БИОЛОГИЙН ХҮЧИН ЗҮЙЛҮҮД

ДНХ-ийн сүүлт одны аргыг ашиглан генотоксик шинж чанарыг үнэлэхin vitro

MP 4.2.0014-10

Оршил

Хүнийг генотоксикантуудтай харьцахаас урьдчилан сэргийлэх нь хүний ​​биеийг мутагенезийн үр дагавраас хамгаалах хамгийн үр дүнтэй арга юм. Үүний зэрэгцээ, асар их хэмжээний судалгааны улмаас ксенобиотик/ксенобиотикийн цогцолборыг генотоксик шинж чанарын нийт шинжилгээ хийх боломжгүй юм. Энэ нь генотоксикологийн судалгааны практикт "тэргүүлэх" сорилтын тухай ойлголтыг нэвтрүүлэхэд хүргэсэн. Тэргүүлэх туршилт хийх шаардлагатай эм, хүнсний нэмэлт, пестицид, үнэртэн, гоо сайхны бүтээгдэхүүн, гэр ахуйн химийн бодис, түүнчлэн хамгийн өргөн тархсан ус, агаар бохирдуулагч, үйлдвэрлэлийн аюул. Зардлыг бууруулж, удамшлын скринингийг хурдасгахын тулд генотоксик шинж чанарыг энгийн бөгөөд хурдан аргаар судалж, бичил биетэн эсвэл хөхтөн амьтдын эсийн өсгөвөрийг туршилтын объект болгон ашигладаг.

Эдгээр асуудлыг шийдвэрлэх генотоксикологийн арсеналд байгаа аргуудаас хамгийн ирээдүйтэй арга нь бие даасан эсийн гель электрофорез эсвэл ДНХ-ийн сүүлт одны арга юм. Энэ арга нь өндөр мэдрэмжтэй бөгөөд олж авсан үр дүнгийн өндөр найдвартай байдлыг хангадаг.

Эдгээр удирдамж нь систем дэх хөхтөн амьтдын эсийн ДНХ-ийн сүүлт одны аргыг ашиглан генотоксик шинж чанарыг үнэлэх журмыг агуулдаг.in vitro. Энэхүү туршилтын системийн давуу тал нь энгийн, хэмнэлттэй, үр дүнг гаргах хурд юм. Нэмж дурдахад, систем нь орчин үеийн ёс зүйн шаардлагыг хангаж байгаа бөгөөд үүний дагуу туршилтанд хөхтөн амьтдын хэрэглээг хязгаарлах ёстой.

1 ашиглалтын талбар

Удирдамжхор судлалын (генотоксикологийн) судалгаа, хүнсний бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг турших зориулалттай. хүнсний нэмэлтүүд, будагч бодис гэх мэт), биологийн идэвхт хүнсний нэмэлт, тэдгээрийг үйлдвэрлэх түүхий эд, үнэртэн, гоо сайхны бүтээгдэхүүн, амны хөндийн эрүүл ахуйн бүтээгдэхүүн, гэр ахуйн химийн бодис, полимер материал, тэдгээрээс хийсэн төрөл бүрийн бүтээгдэхүүн (хүүхдийн бүтээгдэхүүн, түүнтэй харьцах бүтээгдэхүүн) хүнсний бүтээгдэхүүн), түүхий эд, бүтээгдэхүүн, түүний дотор нано технологи ашиглан олж авсан бүтээгдэхүүн, түүнчлэн объект, хүрээлэн буй орчны хүчин зүйлүүд (төвлөрсөн эх үүсвэрээс ус, бохир ус гэх мэт).

2. Аргын зарчим

Энэ арга нь агароз гель дотор хаалттай задарсан бие даасан эсүүдийн гэмтсэн ДНХ ба/эсвэл ДНХ-ийн хэсгүүдийн тогтмол цахилгаан талбарт янз бүрийн хөдөлгөөнийг бүртгэх дээр суурилдаг. Энэ тохиолдолд ДНХ нь анод руу шилжиж, параметрүүд нь ДНХ-ийн гэмтлийн зэргээс хамаардаг "сүүлт сүүл"-тэй төстэй электрофоретик ул мөр үүсгэдэг.

Аргын ерөнхий журамд гель слайд (субстрат) бэлтгэх, микрослайд бэлтгэх, лизис, шүлтлэг денатураци, электрофорез, саармагжуулах, будах, микроскопийн шинжилгээ хийх зэрэг орно. Гель слайдыг агароз гельээр бүрсэн шилэн слайд ашиглан бэлтгэдэг. Туршилтын дээжийг эсүүдээр өсгөвөрлөж, дараа нь бэлтгэсэн гель слайд дээр агароз гель хийнэ. Гель хатууруулсны дараа эсүүд задралд өртөж, эсийн болон цөмийн мембраныг устгах, ДНХ-уургийн цогцолборыг задлахад хүргэдэг. Шүлтлэг денатураци (рН > 13) явагддаг бөгөөд энэ нь шүлтлэг-тэмцэгтэй ДНХ-ийн хэсгүүдийг нэг хэлхээний тасалдал болгон хувиргаж, дараа нь электрофорез хийдэг. Шүлтлэг электрофорез дууссаны дараа слайдыг саармагжуулж, будаж, флюресцент микроскопоор шинжилнэ. Дараа нь сүүлт одны дижитал зургийн компьютерийн шинжилгээг тусгай програм хангамж ашиглан хийдэг бөгөөд гол үзүүлэлт нь сүүлт одны сүүл дэх ДНХ-ийн хувь болон бусад үзүүлэлтүүд юм.

3. Тоног төхөөрөмж, материал, урвалж

Босоо урсгалтай ламинар урсгалтай кабинет
Эпифлуоресценцийн микроскоп
Өндөр мэдрэмжтэй дижитал камер эсвэл микроскоп адаптертай видео камер
Урвуу микроскоп
CO 2 - Лабораторийн сэгсрэгч инкубатор, Vortex төрлийн	TU 64-1-1081-73
рН тоолуур эсвэл аналог	TU-4215-00-18294344-01
Лабораторийн термометр 0 - 55 ° C
Гэр ахуйн хөргөгч
Туршилтын хоолойн микротермостат 25 - 99 ° C
Хэвтээ электрофорез хийх камер
Электрофорезын тэжээлийн хангамж (хүчдэлийн зохицуулалтын хүрээ 400 В хүртэл)
Лабораторийн центрифуг
Микро гуурсан хоолойн лабораторийн центрифуг
Соронзон хутгагч	TU 25-11-834-73
Аналитик баланс (зөвшөөрөгдөх алдааны хязгаар 0.01 мг-аас ихгүй)
Цахилгаан зуух
Шилэн колбо, хэмжих цилиндр
0.5 ба 1.0 дм 3 багтаамжтай шилэн лабораторийн колбонд
Тагтай 0.5 ба 1.5 см 3 хэмжээтэй конус хэлбэрийн пропилен микрогуурс
0.5 ба 1.5 см 3-ийн багтаамжтай бичил хоолойн тавиур
Станц дахь хувьсах эзэлхүүнтэй диспенсерүүдэд зориулсан нэг удаагийн зөвлөмж
Автомат хувьсах эзэлхүүн түгээгч	TU 9452-002-33189998-2002
Дохионы цаг	ТУ 25-07-57
Эмнэлгийн хясаа
Металл хусуур
Горяевын дагуу цусны эсийг тоолох камер	TU 42-816
Микрослайд хийх зориулалттай нүдний шил
Слайд нүдний шил
Лабораторийн шилэн архины гэрэл
AFA-VP-10 шүүлтүүр	TU 95-743-80
Шүүлтүүрийн цаас
Бүх нийтийн агароз I төрөл
Агароз бага хайлах (бага хайлах) VII төрөл
Нэрмэл ус
Натрийн гидроксид
Этилендиамин-N,N,N¢ ,N ¢ - тетра цууны хүчлийн динатрийн давс дигидрат
N-lauroylsarcosine натрийн давс
Натрийн хлорид
Хоёр орлуулсан натрийн фосфат
Калийн фосфат моно орлуулсан
Калийн хлорид
Трис (гидроксиметил) аминометан	TU 6-09-4292-76
Triton X-100
Этидиум бромид	TU 6-09-13-452-75
SYBR Green 1 будаг (ДНХ-ийн дүрслэлд ашигладаг бусад будагч бодисуудыг ашиглах боломжтой: DAPI; пропидиум иодид, акридин жүрж гэх мэт)
Ургийн үхрийн ийлдэс
DMEM орчин;
RPMI-1640 орчин
Фиколл-Паке хольц эсвэл үүнтэй төстэй
L-глутамин
Пенициллин
Стрептомицин

3.1. Судалгааны объектын шинж чанар

Генотоксик шинж чанарыг үнэлэхийн тулд генотоксикологийн судалгаанд (захын цусны лимфоцит ба хүний ​​фибробласт, HeLa умайн хүзүүний хорт хавдар, уушигны A-549 хавдар, Hep2 төвөнхийн хорт хавдар гэх мэт) уламжлалт аргаар ашигладаг анхдагч ба тасралтгүй хүний ​​эсийн өсгөвөрийн эсийг туршилтын объект болгон ашигладаг. . Эдгээр туршилтын объектуудын дунд захын цусны лимфоцит, хүний ​​фибробласт эсвэл HeLa-ийн эсийн өсгөвөрийг ашиглах нь зүйтэй бөгөөд энэ нь бусад эсүүдтэй харьцуулахад тэдний хэд хэдэн давуу талтай холбоотой юм: материалыг олж авах процедурын энгийн байдал; эсийн популяцийн өндөр синхрончлол, биологийн үйл явцын талаархи өргөн мэдлэг.

4. Үргэлжилсэн эсийн өсгөвөрийг тариалах

Фибробласт ба HeLa эсийг DMEM-д 0.3 мг/мл L-глютамин, 10%-ийн ургийн үхрийн ийлдэс (Cibro BRL, АНУ), 100 U/мл пенициллин, 0.1 мг/мл стрептомицин агуулсан хяналттай нөхцөлд өсгөвөрлөнө (37 ° C,). 5% CO 2 ) 25 см 2 ёроолтой хуванцар саванд (үрийн агууламж 1´ 10 6 эс / шил).

5. Судалгаанд бэлтгэх

5.1. Уусмал ба буфер бэлтгэх

фосфат-давсны уусмал буфер (ФСБ) рН 7 ,4 (дэлгүүр цагт 4 °C).

фосфат-давсны уусмал буфер -тай 1 мм EDTA- На (ФСБ+ EDTA) рН 7 ,4 (дэлгүүр цагт 4 °C).

нийтийн 1 % агароз. Усан халаагуурт таглаатай шилэн саванд PBS + EDTA дахь универсал агарозын 1% 10 мл уусмалыг бүрэн тунгалаг гель авах хүртэл бэлтгэнэ.

Бага хайлах 1 % агароз. PBS + EDTA-д бага хайлдаг агарозын 1% -ийн уусмал бэлтгэж, бүрэн ил тод агароз гель авах хүртэл микротермостатад 70 ° C-д өсгөвөрлөнө. Бэлтгэсэн агароз гель (39 ± 2) ° C хүртэл хөргөнө.

Бага хайлах 0 ,5 % агароз.

Үндсэн lysing шийдэл. Үндсэн задралын уусмалыг бэлтгэнэ - 10 мМ Tris-HCl (рН 10), 2.5 М NaCl, 100 мм EDTA-Na. Уусмалыг тасалгааны температурт нэг сарын турш хадгална.

Ажлын лизис уусмалыг туршилтын өдөр бэлтгэж, шууд хэрэглэнэ.

Хоол хийх 1 % шийдэл Тритон-X100 В ихэвчлэн lysing шийдэл.

Шүлтлэг шийдэл Учир нь электрофорез (рН13). 0.3М NaOH ба 1мМ EDTA-Na-ийн уусмал бэлтгэнэ. Уусмалыг 4 хэм хүртэл хөргөнө.

Шийдэл этидиум бромид. PBS-д 2 мкг/см3 этилийн бромидын концентрацитай уусмал бэлтгэнэ. Үүссэн уусмалыг 4 хэмд хадгална.

SYBR Ногоон I. TE буферт SYBR Green I 1:10000 уусмал бэлтгэнэ. Үүссэн уусмалыг 40С-ийн температурт 2 долоо хоногоос илүүгүй хугацаанд хадгална.

6. Судалгааны объектыг бэлтгэх

6.1. Шилжүүлэн суулгах эсийг бэлтгэх

Туршилтын өмнөхөн эсийн нэг давхаргыг Ca 2+, Mg агуулаагүй PBS-ээр 2 удаа угаана. 2+ 0.05% трипсиний уусмал (нэг шил тутамд 1 см 3) 5 минутын турш хийнэ. Дараа нь трипсиныг эсийн өсгөвөрлөгчөөр идэвхгүйжүүлж, эсийг нэгэн төрлийн суспенз үүсэх хүртэл орчинд болгоомжтой соруулна. Үүний дараа эсийг центрифуг хийх замаар үрэлдүүлнэ (5 мин 400g). Үүний дараа эсийг PBS + EDTA (4 ° C) -ийн хөргөсөн уусмалд дахин 2 удаа угаана.

Эсийн амьдрах чадварыг 0.4% трипан хөхөөр будах замаар үнэлдэг. Эсийн суспензийг 1-ийн концентраци хүртэл шингэлнэ´ 10 6 эс / см 3 (эсийн тооллогыг Горяевын камерт хийдэг). Микрослайд авахын өмнө эсийг 40С-т 3 цагаас илүүгүй хугацаанд хадгалж болно.

6.2. Захын цусны лимфоцитыг олж авах

Судалгаанд 20-40 насны, химийн үйлдвэрлэлийн чиглэлээр ажилладаггүй, ионжуулагч цацрагийн эх үүсвэртэй холбоогүй, сүүлийн 3-6 сарын хугацаанд вируст өвчнөөр өвчлөөгүй, эрүүл саруул доноруудаас цус авч байна. сүүлийн 6 сарын хугацаанд рентген оношилгоонд хамрагдаагүй. Цусны нэг хэсгийг шоо венийн судлаас асептик аргаар гаргаж аваад антикоагулянт агуулсан ариутгасан хоолойд шилжүүлнэ. Бүтэн цусыг ижил хэмжээний RPMI-1640 (L-глютамингүй) тэжээлтэй хольж, Фиколл-ийн градиент хольц дээр болгоомжтой хийнэ.Паке (эсвэл үүнтэй төстэй) нягт 1.077 ба центрифуг 400 г40 минутын дотор. Фазын тусгаарлалтанд үүссэн мононуклеар эсийн "цагираг"-ыг пипеткээр сайтар сонгож, тэжээлт бодисоор хоёр удаа угаана.RPMI-1 640-ийг 400 г-т центрифуг хийх замаар10 минутын дотор. Хоёр дахь угаалга хийсний дараа тунадасыг орчинд шингэлнэRPMI-1640 нь эсийн концентраци 1 - 5 хүртэл´ 10 5 /см 3, хэрэглэх хүртэл 4 ° C-т хөргөгчинд хийнэ.

6.3. Туршилтын дээж бэлтгэх

6.3.1. Уусгагч

Гидрофил бодисуудтай ажиллахдаа нэрмэл усыг уусгагч болгон ашигладаг. Гидрофобик бодисуудтай ажиллахдаа диметил сульфоксид эсвэл диметил сульфоксидыг уусгагч болгон ашигладаг. этанолэцсийн концентрацид 1% -иас ихгүй байна. Шаардлагатай бол бусад уусгагчийг хортой нөлөө үзүүлэхгүй концентрацид хэрэглэхийг зөвшөөрдөг бөгөөд үүнийг туршилтаар тогтоосон байх ёстой.

6.3.2. Хяналтууд

Сөрөг хяналт болгон тэнцүү хэмжээгээр нэмсэн уусгагчийг ашигладаг. Устөрөгчийн хэт ислийг эерэг хяналт болгон ашигладаг. Хэрэглэхийн өмнө нэн даруй хөргөсөн (4 ° C) PBS дахь устөрөгчийн хэт ислийн 1 мм-ийн уусмал бэлтгэнэ.

6.3.3. Концентрацыг туршсан

Хуурамч эерэг эсвэл худал сөрөг үр дүнг гаргахгүйн тулд дээжийг инкубацийн орчны рН ба/эсвэл осмосын даралтыг өөрчлөхгүй концентрацид туршина.

Судалгаа нь эсийн хоруу чанарыг тодорхойлохоос эхэлдэгin vitro. 1/2 LC-ийг туршилтын хамгийн их концентраци болгон авна 50 . Хэрэв LC 50-ийн 1/2 нь 10 мм-ээс хэтэрсэн бол сүүлчийнх нь хамгийн их концентрацийг авна. Хоргүй, хоргүй дээжийн хувьд хамгийн их концентраци нь 5 мг/см3, 5 мкл/см3 эсвэл 10 мМ байна. Судалгааны дараагийн хоёр концентраци нь хамгийн ихдээ 1/10 ба 1/100 байна.

6.3.4. Үнэртэй ус, гоо сайхны бүтээгдэхүүн, амны хөндийн эрүүл ахуйн бүтээгдэхүүн бэлтгэх

Шинжилгээний дээжийн хандыг 2003 оны 1-р сарын 29-ний өдрийн MP No 29 FC/394-ийн дагуу нэрмэл усанд дусаах замаар бэлтгэнэ. Дээжний жин ба загвар орчны эзэлхүүний (нэрмэл ус) хоорондын харьцааг Хүснэгтэнд үзүүлэв. . Дээжийг хуурай, цэвэр колбонд жигнэж, түүнд шаардлагатай хэмжээний загвар зөөгчийг нэмнэ. Загвар зөөвөрлөгчийг өөр колбонд хийнэ, хоёр колбыг термостатад 24 цагийн турш 37 ° C температурт хийнэ. Олборлолт дууссаны дараа уусмалыг өрөөний температурт хөргөнө.

Хүснэгт 1

Ханд бэлтгэх нөхцөл

	Дээжийн жин, г	Загварын орчны эзэлхүүн, мл	Дээж шингэлэх хурд	Олборлолтын үргэлжлэх хугацаа, цаг
Үс болон биед зориулсан шампунь
Ариун цэврийн шингэн саван
Усанд орох хөөс, шүршүүрийн гель
Аэрозолийн савлагаатай дезодорант ба үс арилгах эм
Үнэртэй ус, үнэртэй ус, үнэртэй ус, сүрчиг, спирт агуулсан тос
Шүдний оо, цайруулах систем

Олборлолт дууссаны дараа уусмалыг цаасан шүүлтүүрээр шүүнэ. Загварын орчин нь мөн шүүлтүүрт ордог. 9 см диаметртэй AFA-VP-10 шүүлтүүрийг ашигладаг.Цаас шүүлтүүрийг нэрмэл усаар урьдчилан угаана. Үүнийг хийхийн тулд 10 цаасан шүүлтүүрийг 1.5 литр нэрмэл усаар дүүргэсэн том шилэнд хийнэ. Шилийг таглаад 37 0С-т 24 цагийн турш термостатад хийнэ. Дараа нь усыг зайлуулж, шүүлтүүрийг зайлуулахгүйгээр хатаана: шилнээс, термостатад тогтмол жин хүртэл. Тогтмол массад хүрэх нь шүүлтүүр бүрийг аналитик жин дээр жинлэх замаар хянадаг.

6.3.5. Ахуйн химийн бүтээгдэхүүн бэлтгэх

Уусмалын дээжийг 12/27/01-ний өдрийн MP No 29 FC/4746-ийн дагуу бэлтгэсэн. Туршилтын дээжийг 0.1 г хэмжээтэй, 250 см 3 хэмжээтэй таглаатай хэмжээст колбонд хийж, нэрмэл усаар тэмдэглэсэн хэмжээнд хүргэсэн нь дээжийн 1:2500 шингэрүүлэлттэй тохирч байна. Энэхүү шингэрүүлэлт нь судалгааны стандарт юм угаалгын нунтаг. Хоёр дахь колбонд 250 см 3 нэрмэл усыг хяналтын хэлбэрээр хийнэ. Хоёр колбыг 24 цагийн турш 37 ° C температурт термостатад хийж, дараа нь өрөөний температурт хөргөнө. Хөргөлтийн дараа хяналтын болон туршилтын дээжийг цаасан шүүлтүүрээр шүүнэ.

6.3.6. Полимер материалаас бүтээгдэхүүн бэлтгэх

Полимер материалаар хийсэн бүтээгдэхүүний дээжийг 1995 оны 12-р сарын 20-ны өдрийн MU No 1.1.037-95-ийн дагуу бэлтгэсэн.

Полимер материалаар хийсэн бүтээгдэхүүнийг хамгийн ихдээ 20 хөндлөн огтлолтой хэсэг болгон бутлана´ 20 мм. 30 гр дээжийг 250 см 3 багтаамжтай халуунд тэсвэртэй колбонд хийж, 100 см 3 буцалж буй нэрмэл ус хийнэ. Яндангийн температур 37 ° C хүрэхэд колбыг термостатад хийж, 37 ° C-ийн температурт 24 цаг хүртэл байлгана.

6.3.7. Микрослайд хийх слайд бэлтгэх

Өөх тосгүй шилэн гулсуурыг 65-70 хэм хүртэл халаадаг цахилгаан халаагуурын термостат удирдлагатай гадаргуу дээр байрлуулна.° C. 25 мм 2 шилэн талбайд 20 мм 3 харьцаатай 1% агарозыг тарааж, шилний ирмэг дээр тараагчаар түрхэж, бүх гадаргуу дээр жигд тараана. Гель бүрэн хатсаны дараа нүдний шилийг аваад тасалгааны температурт хөргөнө. Микрослайдад зориулж бэлтгэсэн слайдыг тасалгааны температурт 1 сарын турш хадгалж болно.

7. Туршилт хийх журам

7.1. Туршилтын дээж бүхий эсийг инкубаци хийх

5 мм 3 PBS агуулсан микро гуурсанд туршилтын дээжийн 20 мм 3 уусмал, 225 мм 3 эсийн суспенз (1) нэмнэ.´ 10 6 эс/см 3). Уусгагчийг хянахын тулд 5 мм 3 PBS, 20 мм 3 уусгагч, 225 мм 3 эсийн суспензийг бичил хоолойд хийнэ (1).´ 10 6 эс/см 3). Дээж бүхий эсийн суспензийг 37 ° C-т 30 минут 3 цагийн турш өсгөвөрлөнө. Инкубацийн төгсгөлд хуруу шилийг 400 г-т 5 минутын турш центрифуг хийнэ. Илүүдэл шингэнийг асгаж, тунадасжсан эсүүдийг 5 минутын турш 400 г-т центрифугийн аргаар PBS + EDTA-д хоёр удаа угаана. Хоёр дахь угаалга хийсний дараа тунадасжсан эсийг PBS + EDTA-аар шингэлж, микрослайд авах процедурыг нэн даруй эхлүүлнэ. Туршилтын цэг бүрийг дор хаяж хоёр давталтаар, давталт бүрт гурван микробэлтгэл хийдэг.

Устөрөгчийн хэт ислийн 25 мм 3 уусмалыг бичил хоолойд нэмж, 225 мм 3 эсийн суспензийг нэмнэ (1´ 10 6 эс/мл) ба 40С-т 5 минутын турш өсгөвөрлөнө. Инкубацийн төгсгөлд хоолойнуудыг 400 граммаар 5 минутын турш центрифуг хийнэ. Илүүдэл шингэнийг асгаж, тунадасжсан эсүүдийг 5 минутын турш 400 г-т центрифугийн аргаар PBS + EDTA-д хоёр удаа угаана. Хоёр дахь угаалга хийсний дараа тунадасжсан эсийг PBS + EDTA-аар шингэлж, микрослайд авах процедурыг нэн даруй эхлүүлнэ.

7.2. Микрослайд бэлтгэх

Микрослайд авахын тулд стандарт бус хэмжээтэй слайдыг ашиглахдаа судалж буй эсүүдийг "сэндвич" зарчмын дагуу гурван давхаргат агароз блокуудад хөдөлгөөнгүй болгодог. Хатаасан универсал 1% агароз агуулсан слайд дээр бүх нийтийн 1% агарозын давхаргыг хэрэглэнэ. Гельийг хатууруулахын тулд 4 ° C-т 5 минутын турш хөргөнө. Микро гуурсанд 1% хайлах багатай агарозыг туршилтын дээжинд орсны дараа эсийн суспензтэй тэнцүү хэсгүүдэд (1:1) хурдан хольж, дараагийн давхарга болгон хэрэглэнэ. Гельийг хатууруулахын тулд 4 ° C-т 5 минутын турш хөргөнө. Үүний дараа гурав дахь давхарга - 0.5% бага хайлсан агарозыг хэрэглэж, 4 ° C-т 5 минутын турш хөргөнө.

Стандарт шил хэрэглэх үед 60 мм3 эсийн суспензийг 240 мм 3 агароз гель бүхий микроцентрифугийн хоолойд нэмж, диспенсерээр 2-3 удаа шахна. Үүссэн эсүүдтэй 60 мм 3 агароз гельийг слайдын төв хэсэгт түрхэж, бөмбөлөг үүсэхгүйн тулд өнцгөөр хучигдсан байдаг. Слайдуудыг мөстэй савны гадаргуу дээр байрлуулж, гель хатууруулахын тулд 10 минутын турш үлдээнэ. Хавтасны хаалтыг болгоомжтой авч (ирмэгийг нь татаж), слайдыг шилэн кюветт хийнэ.

7.3. Лизис

Ажлын задралын уусмалыг микрослайдтай кюветт уусмал нь микрослайдуудыг 2-3 мм-ээр бүрхтэл цутгаж, тагийг нь таглаж, 4 ° C-т 1 цаг өсгөвөрлөнө. 24 цаг хүртэл.

7.4. Шүлтлэг денатураци

Лизисийн төгсгөлд микропрепаратуудыг задралын уусмалаас гаргаж аваад электрофорез хийх зориулалттай хөргөсөн (4 ° C) шүлтлэг уусмал (рН 13) бүхий кюветт рүү шилжүүлнэ. 4 ° C-т 20 минутын турш өсгөвөрлөнө.

7.5. Шүлтлэг электрофорез

Тасалгааны гадаргуу дээр хэвтээ электрофорез хийхэд зориулж бичил бэлдмэлүүдийг тавьдаг. Электрофорезыг 20 - 25 ° C орчны температурт электрофорез хийх (рН 13) хөргөсөн (4 ° C) шүлтлэг уусмалын шинэхэн хэсэгт хийнэ. Заасан температурын нөхцөлд хазайлт нь олж авсан үр дүнгийн хэлбэлзэлд хүргэж болзошгүй юм. Микрослайд хийх тавцангийн уртын 1 см тутамд 1 В-ийн цахилгаан талбайн хүчээр 20 минутын турш электрофорез хийдэг.

7.6. Өнгө будах

Бичил бэлдмэлийг кюветт хийж, давхар нэрмэл усаар дүүргэнэ. Саармагжуулалтыг тасалгааны температурт 5 минутын турш явуулна. Саармагжуулах процедурыг H 2 O-ийн шинэхэн хэсэгт хоёр удаа давтан хийнэ. Бэлдмэлийг SYBR Green I будгаар будахдаа электрофорез хийсний дараа бэлдмэлийг 70% этилийн спиртийн уусмалд 15 минут байлгаад тасалгааны температурт хатаана.

"ДНХ-ийн сүүлт од"-ыг этидиум бромидоор будахын тулд микрослайдыг будгийн уусмал бүхий кюветт дүрж, харанхуй газар 40С-ийн температурт дор хаяж 1 цагийн турш өсгөвөрлөнө.Шинжилгээ хийхийн өмнө шууд "ДНХ-ийн сүүлт од"-ыг бүртгэхээр сонгосон микрослайдыг. нэрмэл усанд 2-3 удаа угаана.

ДНХ-ийн сүүлт одыг будахын тулд SYBR Green I будгийг 25 мм 2 талбайд 100 мм 3 хурдтай микрослайд дээр түрхэж, 20 минутын турш будна. Будгийн төгсгөлд бичил бэлдмэл дээр үлдсэн будгийг арилгадаггүй.

7.7. Микроскопийн шинжилгээ

Микро сорьцыг флюресцент микроскопоор шинжилдэг. Санал болгож буй томруулах хэмжээ x200 - x400. Микрослайд бүрээс доод тал нь 50 ДНХ-ийн сүүлт одыг давхцуулахгүйгээр санамсаргүй байдлаар шинжилдэг. Зураг авах, өгөгдөл боловсруулах нь өндөр мэдрэмжтэй камер эсвэл микроскоптой хослуулсан дижитал камер, тусгай программ хангамжийг багтаасан техник хангамж, програм хангамжийн цогцолборыг ашиглан хийгддэг. Боломжтой програм хангамжаас хамааран ДНХ-ийн сүүлт одны параметрүүдийн шинжилгээг "бодит цаг хугацаанд" эсвэл хадгалсан дижитал зургуудаас хийдэг. Сүүлт одны сүүл дэх % ДНХ-ийг ДНХ-ийн гэмтлийн үзүүлэлт болгон ашигладаг.

8. Статистикийн мэдээлэл боловсруулах

Туршилтын өгөгдлийн статистик боловсруулалтыг туршилтын цэг бүрийн бүх давталтуудад туршилтын болон хяналтын бүлгийн ДНХ-ийн гэмтлийн үзүүлэлтүүдийг Даннеттын параметрийн бус тестийг ашиглан харьцуулах замаар гүйцэтгэдэг. Хоёр давталтаас авсан өгөгдлийг нэгтгэж, 95% -ийн итгэлцлийн интервал давхцаж байвал дундажийг тодорхойлно. Эерэг үр дүнгийн шалгуур нь ДНХ-ийн эвдрэлийн индексийн статистикийн ач холбогдолтой, тунгаас хамааралтай өсөлт эсвэл дор хаяж нэг туршилтын цэгийн хувьд статистикийн ач холбогдолтой, давтагдах боломжтой нөлөө юм. Эерэг үр дүн энэ тестЭнэ нь туршилтын нэгдэл нь тухайн төрлийн эсийн нөхцөлд ДНХ-ийн гэмтэл үүсгэдэг болохыг харуулж байнаin vitro.

9. Үр дүнг танилцуулах маягт

Үр дүнг танилцуулах протокол:

Туршилтын нэр _____________________________________________________

Туршилтын объект (нэр) _____________________________________________________

Бодис (нэр) ________________________________________________________________

Томъёо, физик, химийн шинж чанар _________________________________________________

Хаанаас ирсэн бэ ________________________________________________________________

Уусгагч ______________________________________________________

Эерэг хяналт _____________________________________________________

Уран зохиолын мэдээлэлд дүн шинжилгээ хийх ________________________________________________

Туршилтын загвар ________________________________________________________________

Туршилт хийсэн огноо _______________________________________

Тун _____________________________________________________________________

Үр дүн ________________________________________________

Жүжигчид ________________________________________________________________

Тайлан ирүүлсэн огноо ______________________________________________________

10. Үр дүнгийн тайлбар

Эерэг үр дүнгийн шалгуур нь ДНХ-ийн эвдрэлийн индексийн статистикийн ач холбогдолтой, тунгаас хамааралтай өсөлт эсвэл дор хаяж нэг туршилтын цэгийн хувьд статистикийн ач холбогдолтой, давтагдах боломжтой нөлөө юм. Энэ туршилтын эерэг үр дүн нь туршилтын бодис нь тухайн төрлийн эсийн нөхцөлд ДНХ-ийн гэмтэл үүсгэдэг болохыг харуулж байнаin vitro.

Генотоксик үйл ажиллагааны үзүүлэлт нь дараахь томъёогоор тооцоолсон хохирлын индекс (DI) юм.

PI = туршилтын бүлэгт "сүүл дэх% ДНХ" / хяналтын бүлэгт "сүүл дэх% ДНХ".

Гэмтлийн индекс 2.0-ээс их байвал туршилтын дээж нь нөхцөлд генотоксик шинж чанартай болохыг харуулж байнаin vitro.

Хэрэв эерэг үр дүн илэрсэн бол ашиглалтын аюулгүй байдлыг үнэлэхийн тулд нэмэлт туршилт хийх шаардлагатай.in vivoхөхтөн амьтад дээр.

11. Ашигласан материал

1. Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Анисина Е.А., Сиднева Е.С., Никитина В.А., Оганесянц Л.А., Середенин С.Б., Бекиш В.Я., Чернуха И.М. Байгалийн болон синтетик нэгдлүүдийн генотоксик шинж чанарыг үнэлэхийн тулд тусгаарлагдсан эсийн шүлтлэг гель электрофорезын аргыг хэрэглэх: Арга зүйн зөвлөмж. Москва, 2006, 28 х.

2. Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Оганесянц Л.А. Хүнсний генотоксикологи дахь тусгаарлагдсан эсийн гель электрофорезийн арга (ДНХ-ийн сүүлт одны арга) // Хөдөө аж ахуйн түүхий эдийг хадгалах, боловсруулах. 2007. No 1. C. 31 - 33.

3. Коллинз AR, Оскоз АА, Брунборг Г, Гайвао I, Жованнелли Л, Крушевски М, Смит CC, Стетина Р. Сүүлт одны шинжилгээ: сэдэвчилсэн асуудлууд // Мутагенез. 2008 оны тавдугаар сар; 23(3) : 143 - 51.

4. Сүүлт одны хор судлалын шинжилгээ // A. Dhawan, D. Anderson (Eds); Хааны химийн нийгэмлэг, 2009, 461 х.

5. Dhawan A, Bajpayee M, Parmar D. Сүүлт одны шинжилгээ: янз бүрийн загварт ДНХ-ийн гэмтлийг үнэлэх найдвартай хэрэгсэл // Cell Biol Toxicol. 2009 оны хоёрдугаар сар; 25(1): 5 - 32.

6. Landsiedel R, Kapp MD, Schulz M, Wiench K, Oesch F. Наноматериалуудын генотоксик байдлын судалгаа: арга, туршилтын материалын бэлтгэл ба шинж чанар, боломжит олдворууд ба хязгаарлалтууд - олон асуулт, зарим хариулт // Мутат Рес. 2009 оны 3-р сараас 6-р сар; 681(2 - 3): 241 - 58.

7. Tice RR, Agurell E, Anderson D, Burlinson B, Hartmann A, Kobayashi H, Miyamae Y, Rojas E, Ryu JC, Sasaki YF. Нэг эсийн гель / сүүлт одны шинжилгээ: in vitro болон in vivo генетикийн токсикологийн туршилтын удирдамж // Environ Mol Mutagen. 2000; 35(3): 206 - 21.

8. Хүний эрүүл мэндэд аюул учруулж болзошгүй наноматериалуудыг тодорхойлох заавар: MP 1.2.2522-09. Москва, 2009 он.

9. Наноматериалын аюулгүй байдлын хор судлал, эрүүл ахуйн үнэлгээ: MU 1.2.2520-09. Москва, 2009 он.